提高RT

相关专题

 

摘要

RT－PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT－PCR的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这两个步骤（RT 和PCR）通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一，但是同样因为上述的缓冲液不兼容性，极大地限制了检测灵敏度。eppendorf 设计了一个含有全新化学物质的新试剂盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。本文将对新试剂盒的表现进行检验。

简介

逆转录（RT）以及随后进行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得最广泛的技术之一。如果需要平行分析多个RNA 样品，首选方法为一步法RT－PCR。如果要扩增困难目标片段或从单一cDNA 池中扩增多重目标片段则会选择两步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系统适用于各种RT－PCR 应用。它含有一种全新的重组 逆转录酶和一种具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反应缓冲液能够自动调节镁离子浓度，因此这一重要成分的浓度无需优化。这种自我调节的效果是通过对镁离子的弱螯合作用来实现的。如果镁离子浓度过高，螯合剂会与过剩的镁离子结合，如果反应（Taq 或DNA）需要镁离子，镁离子就会被释放出来。这种创新技术提高了cMaster RTplusPCR的灵敏度和特异性。使cMaster RTplusPCR试剂盒既能进行一步法，又能进行两步法RT－PCR，而且具有很大的动力学检测范围，能扩增得到的PCR产物长度范围也很大（一步法反应最长可扩增5.3 kb片段；两步法方案最长能扩增12.3 kb 片段）。

下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。
实验1关注新试剂盒在一步法RT－PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中，最重要的因素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。

实验2显示应用一步法方案进行长距离RT－PCR 不再是个难题。试剂盒中创新的缓冲液能同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。

本系统提供的两步法RT－PCR 备选程序适用的模板范围很广。实验3描述了对不同模板的扩增情况。这个新的系统能为所有的RT目标提供全面解决方案，不论需要扩增的片段是中等长度还是极长，不同来源的总RNA 中转录本是低丰度还是高丰度。

材料和方法

Eppendorf cMaster RTplusPCR系统
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic试剂盒
所有的PCR反应均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR仪上进行。

实验1：一步法灵敏度检测RT－PCR
扩增目标：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA：从人HELA细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度从1μg递减至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系统，标准一步法RT－PCR方案。1:10 稀释RTplusPCR 缓冲液，镁离子终浓度2.5 mM，反应总体积50μl
循环参数：循环步骤温度时间描述1x150°C30分钟逆转录1x294°C3分钟初始变性40x {394°C15秒模版变性468°C45秒引物退火/延伸

cMaster RTplusPCR 系统显示出一种依赖于模板RNA 量的宽广的产物产量动力学范围。能从低至10 pg 的HELA 总RNA中检测到α微管蛋白mRNA。