DNA 序列分析技术

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物种 的遗传多样性在本质上是DNA 一级序列的多样性。近年来，随着DNA 测序技术的迅速发展和日益普及，DNA 测序在遗传多样性的研究中正在起着越来越大的作用。本章将介绍目前在遗传多样性研究中常用的一种手动和一种全自动双链DNA 测序方法。
1 DNA 模板的制备
在遗传多样性的研究中，由于样本量一般都较庞大，因而DNA 测序 的速度就成了很关键的因素。因此，这类研究中常常直接测定纯化的PCR 双链产物而不大采用克隆技术。本节介绍本实验室常用的从PCR 产物制备测序模板的方法，即低熔点胶回收法。
（1）制备1.5％～2.0％的琼脂 糖凝胶，待其充分凝固后，在离点样线5cm 左右处切下宽约1cm 的胶条，在切出的槽中倒入预先煮沸的低熔点琼脂糖胶。
（2）低熔点胶凝固后，将待纯化的PCR 反应液全部点样，恒压100V 左右进行电泳，直至扩增片段进入到低熔点胶中部。在360nm 紫外光下，将已进入低熔点胶的条带切下，放入1．5ml离心管中。
（3）离心，将胶块压缩到管底，然后补加 TE 至 500μl。于 68℃水浴，将低熔点胶熔化，再迅速加入等体积的水饱和酚并混匀。
（4）室温下振荡抽提10 分钟，再12 000r／min 离心 10 分钟。取上清液再用氯仿-异戊醇（24:1）抽提5 分钟。
（5）12 000r／min 离心 10 分钟，取上清液，在其中加入 1／10 体积的 10 mol／dm3NH4Ac和2 倍体积的无水乙醇，置—70℃下沉淀半小时以上。
（6）再12 000r／min 离心 10 分钟，沉淀用 70％的冷乙醇洗涤；再次短暂离心后小心地倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入20～50μlTE 缓冲液或无菌去离子水 中溶解，即为制好的DNA模板。
目前还有一些非常有效的商售试剂盒可用于纯化 PCR 产物，如 Oiagen PCR 产物纯化试剂盒等，但成本较高。

2 手动DNA 序列分析技术
2.1 测序胶的制备
按以下配方制备测序电泳胶：
6％胶工作液 70ml
10％过硫酸胺（APS） 70μl（新鲜配制）
TEMED 70μl
将上述溶液混合后，灌入准备好的胶板中，将“鲨鱼齿”梳子反插入胶，深约0.5～1.0cm。室温下聚合1 小时左右。
12.2.2 测序反应
测序试剂盒购自美国 USB 公司，测序酶为 Sequenase Version 2.0；α35S-dATP 购自美国
DuPont 公司（1mCui／100μl）。测序反应按USB 推荐的方法进行：
（1）DNA 模板混合液（0．5ml Eppendorf 管）：
DNA 模板 7μl
测序引物 1μl
5 倍 Reaction buffer 2μl
NP4O 1μl
（2）标记混合液（每一反应的量）：
DTT（0.1mol／dm3） 1μl
1／5dGTP labelling mix 2μl
Enzyme dilution buffer 1.75μl
NP4O 0.55μl
去离子水 0.375μl
测序酶 0.125μl
35S-dATP 0.5μl
（3）ddNTP（ddA、ddG、ddC、ddT） 2.5μl
（4）退火反应（annealing）：将DNA 模板混合液煮沸3 分钟，迅速放入乙醇和干冰的混合冰浴箱中退火30 秒左右（如无干冰，则用冷冻于－20℃～－70℃下的无水乙醇，临用前由冰箱中取出）。在进行标记反应之前，反应液需保存于干冰或碎冰中。
（5）标记反应（labelling）：由干冰或冰中取出经退火的DNA 模板混合液，放在手中使其融化，然后加入 5.5μl 的标记混合液。在微型离心机上离心 10～15 秒后，置室温中 1 分钟。（6）链终止反（termination）：将上一步骤制成的混合液以每管3.3μl 分装入预先在37℃下温浴的加有ddNTP 的管中，并在37℃下反应4～5 分钟。
（7）每管加入4μl 终止液（stop solution）。
2.3 电泳
电极缓冲液 1 倍TBE（pH 值8.0）
预电泳 30 分钟至1 小时
恒温方式 测序胶板上夹盖铝恒温板
电泳温度 50℃左右
电泳条件 恒功率 90～110W
电泳时间 2.5 小时至5 小时

2.4 干胶制备和压片
电泳结束后取下胶板，用工具撬开玻璃板，使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧，使胶粘在滤纸上，然后将胶放置于干胶器中制备干胶1～1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将X 光片压于胶上曝光2～3 天。
2.5 X 光片的冲洗
将曝光后的X 光片显影4～8 分钟（根据显影液的使用时间长短而定）；定影5～10 分钟，冲洗后即可读取DNA 序列。

3 自动 DNA 序列分析技术
本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。