DNA 序列分析技术

2.4 干胶制备和压片

电泳结束后取下胶板，用工具撬开玻璃板，使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧，使胶粘在滤纸上，然后将胶放置于干胶器中制备干胶1～1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将X 光片压于胶上曝光2～3 天。

2.5 X 光片的冲洗

将曝光后的X 光片显影4～8 分钟（根据显影液的使用时间长短而定）；定影5～10 分钟，冲洗后即可读取DNA 序列。

3 自动 DNA 序列分析技术

本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。

3.1 混合反应物

（1）取2.5μl 纯化好的PCR 产物［相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，进行琼脂糖凝胶电泳。

（2）凝胶用溴化乙锭染色，用流水冲洗脱色后，在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf

（十）DNA 估测待测DNA 模板的浓度，以确定测序反应中应取的模板量。

（3）在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反应物：

DNA 模板 适量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下变性2 分钟，再冰浴2 分钟后短暂离心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl
终体积 10μl

（4）用微量取样器将反应物充分混合后，加 20μl 石蜡油覆盖。

3.2 热循环反应

该反应中降温时间非常关键（约1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪（PCR 仪，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中，按以下程序进行热循环反应：

（1）96℃ 1 秒钟
96℃ 30 秒钟

（2）50℃ 1 秒钟

50℃ 1 分钟

（3）60℃ l 秒钟
60℃ 4 分钟

共需25 个循环。

3.3 纯化测序产物

纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作过程如下：

（1）轻弹柱，使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。

（2）移去柱上盖，加入 800μl 去离子水，再盖上盖振荡，以除去气泡。

（3）在室温下放置30 分钟，以水化凝胶柱。

（4）移去柱上盖和下盖，将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中，让多余液体流出。

（5）倒去液体，将柱连同洗脱管一起在 3 000r／min 下离心 2 分钟。

（6）将柱放入一个1.5ml 离心管中，用微量取样器将测序反应物取出，注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。

（7）3 000r／min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。

（8）将样品放在真空干燥离心机中干燥。

（9）将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。

应注意的是，Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后，要用自来水洗3 次，蒸馏水洗 2 次，然后倒置于一试管架上晾干后，称取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。

3.4 电泳

使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳，并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。

（1）聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25％，配制过程如下：

尿素 18g
Amberlite 离子交换树脂（Sigma，MB-lA） 约39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去离子水 25ml
将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。

（2）取5ml 10 倍TBE，通过2μm 滤膜抽滤后，再抽滤以上胶液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L

（3）将滤过液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％过硫酸胺（APS），轻摇混合后，用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中

（4）1 小时后，将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟，恒压1kv，并使温度升至 51℃。

（5）预电泳的同时，取出 36 份―70℃下贮存的样品，各加入5μl 载样液（50μl 试剂盒中配备的loading buffer＋250μl 去离子甲酰胺，临用前配制）。

（6）将混合液在旋涡混合器上振荡，94℃下变性2 分钟，冰浴2 分钟后短暂离心。

（7）各取 1.5μl 点样，恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况，此时应人为修复。

2.4 干胶制备和压片
电泳结束后取下胶板，用工具撬开玻璃板，使胶留在其中一块板上。将裁剪好的新华3 号滤纸在胶上贴紧，使胶粘在滤纸上，然后将胶放置于干胶器中制备干胶1～1.5 小时。制好的干胶放入压片盒中，放于暗室中，将X 光片压于胶上曝光2～3 天。

2.5 X 光片的冲洗
将曝光后的X 光片显影4～8 分钟（根据显影液的使用时间长短而定）；定影5～10 分钟，冲洗后即可读取DNA 序列。

3 自动 DNA 序列分析技术

本节描述运用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自动DNA 测序仪进行双链DNA 测序的方法。热循环测序反应使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）进行。操作过程主要根据厂家推荐的方法进行。具体操作方法如下。

3.1 混合反应物
（1）取2.5μl 纯化好的PCR 产物［相对于2.5μl 测序试剂盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，进行琼脂糖凝胶电泳。
（2）凝胶用溴化乙锭染色，用流水冲洗脱色后，在紫外光下进行照相记录。参照pGEM-3Zf
（十）DNA 估测待测DNA 模板的浓度，以确定测序反应中应取的模板量。
（3）在一个标记的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反应物：
DNA 模板 适量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下变性2 分钟，再冰浴2 分钟后短暂离心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中测序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中测序液 4.0μl
终体积 10μl
（4）用微量取样器将反应物充分混合后，加 20μl 石蜡油覆盖。

3.2 热循环反应
该反应中降温时间非常关键（约1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的热循环仪（PCR 仪，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 热循环仪。将反应管放入热循环仪中，按以下程序进行热循环反应：
（1）96℃ 1 秒钟
96℃ 30 秒钟
（2）50℃ 1 秒钟
50℃ 1 分钟
（3）60℃ l 秒钟
60℃ 4 分钟
共需25 个循环。

3.3 纯化测序产物
纯化测序产物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作过程如下：
（1）轻弹柱，使Cephadex G-50 胶粉从柱底部扬起。
（2）移去柱上盖，加入 800μl 去离子水，再盖上盖振荡，以除去气泡。
（3）在室温下放置30 分钟，以水化凝胶柱。
（4）移去柱上盖和下盖，将凝胶柱放入一个配置好的洗脱管中，让多余液体流出。
（5）倒去液体，将柱连同洗脱管一起在 3 000r／min 下离心 2 分钟。
（6）将柱放入一个1.5ml 离心管中，用微量取样器将测序反应物取出，注在凝胶柱中央。注意避免带入石蜡油。
（7）3 000r／min 下离心 2 分钟。应注意柱的定向必须与第一次离心时一致。
（8）将样品放在真空干燥离心机中干燥。
（9）将干燥后的样品贮存于―70℃下待进行电泳。在此条件下保存1 年之久的样品其荧光也不会猝灭。
应注意的是，Centri-sep 柱体可反复使用多次。每次使用过后，要用自来水洗3 次，蒸馏水洗 2 次，然后倒置于一试管架上晾干后，称取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。

3.4 电泳
使用ABI 公司的377 型全自动DNA 序列分析仪电泳，并记录序列数据。控制软件为PRIM377 Collection。电泳过程如下。
（1）聚丙烯酚胺凝胶浓度为4.25％，配制过程如下：
尿素 18g
Amberlite 离子交换树脂（Sigma，MB-lA） 约39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去离子水 25ml
将混合液在电磁搅拌器上搅拌10 分钟。
（2）取5ml 10 倍TBE，通过2μm 滤膜抽滤后，再抽滤以上胶液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L
（3）将滤过液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％过硫酸胺（APS），轻摇混合后，用50ml 无针头注射器将胶注入已装配好的玻璃板中。
（4）1 小时后，将胶安装于全自动序列仪上预电泳 30 分钟，恒压1kv，并使温度升至 51℃。
（5）预电泳的同时，取出 36 份―70℃下贮存的样品，各加入5μl 载样液（50μl 试剂盒中配备的loading buffer＋250μl 去离子甲酰胺，临用前配制）。
（6）将混合液在旋涡混合器上振荡，94℃下变性2 分钟，冰浴2 分钟后短暂离心。
（7）各取 1.5μl 点样，恒压 1.68kv 电泳 7 小时。机器将自动分析和记录序列结果。常有电泳道识别错误的情况，此时应人为修复。