九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
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1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
1.外源基因在原核细胞中的表达
蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程 中占有非常重要的地位。常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌 表达系统的特点：
生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；
已开发较多的克隆载体 可供选择；
容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌 总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：
原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。而在真核基因上则缺乏该序列。因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控
启动子是转录水平调控的主要因素。根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。有些启动子的活性可以通过物理或化学的方法诱导调控。在基因工程中，原核表达系统通常采用可调控的强启动子。常用的原核启动子有：由异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子，由3-吲哚乙酸（IAA）诱导的trp启动子，由温度诱导的PL和PR启动子等。噬菌体 T7 RNA聚合酶启动子是一个很强的启动子，近年来在原核表达中得到广泛应用。
SD序列是原核表达中翻译水平的重要调控因素。SD序列和16S RNA3′端的互补程度、SD序列和目的基因间的距离在很大程度上影响蛋白的合成量。
（4）蛋白质在原核细胞中的表达形式
外源基因在原核细胞中可以以非融合蛋白、融合蛋白和分泌型表达等不同形式进行表达。具体要根据表达产物使用的目的和操作方法进行选择。
非融合蛋白使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读框。非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同，是一些体内应用基因工程产品的必要条件。但是非融合蛋白在原核细胞内不稳定，易被降解，而且不易纯化。
融合蛋白指的是在表达产物的N端或C端具有非目的蛋白的氨基酸残基。融合蛋白使用的外源基因，必须注意其读框和载体上原核读框相符和。融合蛋白在大肠杆菌内较稳定，不易被降解。而且，作为融合蛋白一部分的原核多肽往往是用于纯化，或是作为检测该融合蛋白的“标签（tag）”。如本实验中采用金属螯合亲和层析技术纯化带6个His标签的融合蛋白。
分泌型表达指的是在细胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质。进行分泌型表达时，要将一段原核或真核的信号肽序列连接在待表达基因的上游。常用的信号肽有ompT、phoA、pelB等，在表达的蛋白进入细胞周间质时，信号肽被蛋白酶水解，产生游离的表达产物。因此，分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解，增加表达产物的稳定性，同时，表达蛋白的生物活性较好，易于纯化，但是，表达量往往比较低。
2.乳糖操纵子的调节机制
操纵子是原核细胞基因表达的协调单位。通常由两个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成（如图1）。
乳糖操纵子的调节包括乳糖（或IPTG）的诱导效应和葡萄糖的降解物阻遏效应。
（1）乳糖操纵子的诱导表达
当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中目的基因为绿色荧光蛋白基因）不能转录，也就不能翻译出目的蛋白。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态（如图2）。
当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3′端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导（如图3）。
乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。
（2）乳糖操纵子的降解物阻遏
当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏（catabolic repression）。
降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein，CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP），属于一种激活蛋白，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内同时具有DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合到CAP结合位点上，促进转录。葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。
（3）阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调
当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时，操纵子发挥最大转录活性。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。
本实验使用的表达载体p32aGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带6XHis（组氨酸标签）的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属鳌合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。
（一）试剂
1.LB 液体培养基 2L
2.10mg/mL氨苄青霉素溶液 10mL（全班共用）
3.100 mmol/L IPTG溶液 10mL（全班共用）
4.20%葡萄糖溶液 10mL（全班共用）
5.超声平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0 500mL
（二）器材
超净工作台、恒温振荡器、台式高速离心机、高速冷冻离心机、低温摇床、高压破碎仪或超声破碎仪等。
（三）菌株
工程菌BL21(DE3)pET-32a和工程菌BL21(DE3)p32aGFPuv。
1.分别挑取工程菌BL21(DE3)pET-32a和BL21(DE3)p32aGFPuv的单菌落接种到5mLLB液体培养基（含氨苄，终浓度为100μg/mL，以下同）。
2.于37℃、250r/min培养过夜（12h－14h）至对数生长期。
3.取三支灭菌试管，各加入5mL LB液体培养基(含氨苄），分别编号为1#，2#，3#，另外取装于500mL三角瓶中的150mL LB液体培养基（含氨苄），编号6#， 全部按1：50的比例接种。1# 接种100μL BL21(DE3)pET-32a，2# 接种100μL BL21(DE3)p32aGFPuv，3# 接种100μL BL21(DE3)p32aGFPuv，6# 接种3mL BL21(DE3)p32aGFPuv。
4.于37℃、250r/min培养约2h－3h。
5.诱导处理：1#、2#不需处理；3#加入20％葡萄糖100μL至终浓度为0.4％，加入5μL 100mmol/L IPTG至终浓度为0.1mmol/L；6#加入100mmol/L IPTG约150 μL至终浓度为0.1mmol/L。
6.于21-25℃、250r/min培养约10h－12h或过夜。
7.收菌 （注意采集标本并编号）：①从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为4#）。②分别从1#，2# ，3#培养物各取100μL于EP管用于SDS-PAGE。③将1#，2#，3#，4#试管中的菌液分别收集到4个1.5mLEP离心管中，编上相应编号。1#，2#，3#离心弃上清；4#上清收集到另一个EP管，编号为5#。④6#三角瓶中剩余菌液用 50mL离心管于5000r/min，4℃，离心10min，弃上清收集菌体。
8.于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光（荧光强弱），记录观察到的现象，并拍照。
9.6#收集的全部菌体用50mL超声平衡缓冲液重悬（50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl pH7.0)。
10.超声波破菌或高压破菌，然后用50mL离心管于8000r/min，4℃，离心40min，取上清（弃沉淀）。上清可保存于-20℃冰箱，作下一步亲和层析实验用。
超声操作：冰浴下进行，功率为400W，工作4s，间隙4s，为一次，99次为一周期。共处理六周期。
高压破碎操作：压力约为150MPa。注意根据裂解液浑浊程度控制流速，1drops/1~4seconds。
1.本实验的目的是比较重组DNA在大肠杆菌中表达时是否受IPTG和葡萄糖存在的影响，所以1#、2#管的细菌在25-28℃培养时不加IPTG和葡萄糖，3#管除加IPTG外还加入葡萄糖，糖的浓度要大于0.2%以上（本实验采用0.4％）。4#三角瓶细菌仅加IPTG 也仅指这次实验所用的重组DNA菌体而言。有的重组DNA菌体在其表达时除需加IPTG外仍需加入少量的葡萄糖为碳源作诱导。在转管培养及收菌时要注意各管编号要相应对好，不能混乱。
2.不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往受到IPTG浓度和温度的影响，最好采用不同温度或不同浓度的IPTG来诱导，观察哪种温度或哪种浓度条件下其蛋白表达量最大。在科研中一般都要求这样做。
3.由于本实验所表达的目的蛋白带有绿色荧光蛋白，其在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后收集的菌体在紫外线的照射下都可见黄绿色荧光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在紫外灯下观察其是否有荧光及其荧光的强弱，就可判断其是否有表达及其所表达的强度。
【实验安排】
1.第一天晚上9时左右活化种子菌。
2.第二天上午配制培养基及灭菌，下午至晚上做放大接菌和诱导。
3.第三天上午收菌、观察、拍照、破碎菌体、离心收集蛋白。
1.对紫外灯下观察到的结果作出解释。
2.为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为0.5时加入IPTG？
3.大肠杆菌的诱导表达常受哪些因素的影响？
