DNA胶回收中常见问题分析
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DNA胶回收中常见问题 分析
1、如何计算提取率?
1) 回收前样品中,往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等,所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率;
2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳,使用凝胶成像系统拍照后,用配套的软件 进行电泳条带灰度对比;
3) 注意,电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响,请仔细操作,以减小误差。
2、如何简易测算提取率?
取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10,与等体积的回收前的DNA溶液的5—10倍稀释液一起电泳,肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度,粗略测算回收率(如亮度只有一半时,其回收率可粗略为50%)。
3、如何看待提取得率?
影响回收率的因素很多,如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等,所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏,最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验,结果相对真实。
4、回收率为什么与点样量和片段大小有关?
DNA片断越大,和固相基质的结合力越强,就越难洗脱,回收率就低;DNA的量越少,相对损失越大,回收率越低。
5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因?
1) 胶块溶解不完全,可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例;
2) 胶块体积太大,应使用枪头捣碎,还不能充分溶解则先将其切为小块,分多次回收;
3) 紫外灯下切胶时间过长,导致DNA部分降解,应尽量把切胶时间控制在30s以内;
4) 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖,乙醇挥发,影响回收效率;
5) TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜,失去了缓冲能力,导致PH值升高,降低DNA和膜的吸附力,应及时更换电泳缓冲液,最好使用新鲜配制的电泳缓冲液,效果更好。
6) 回收前的样品量太少,加大点样量
7) 洗脱前,预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。
6、加入溶胶液温浴后,液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象?
1) 胶块溶解不充分,可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶;
2) 胶块体积过大,应尽量切除多余部分,并将其切为小碎块,分几次回收;
3) 水浴温度是否达到规定温度65℃,用温度计检测。
7、琼脂 糖凝胶块不溶?
1) 琼脂糖质量不好;
2) 含目的片断的凝胶在空气中放置过久,使胶块失水干躁,建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃;
3) 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
8、点样时发现DNA样品有漂出点样孔外的现象?
柱子上的乙醇未完全挥发干净,延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。
9、能否使用去离子水 洗脱回收?
可以,但是实验室所用去离子水一般PH值偏低,可用NaOH适当调高PH值>7.0,以增加回收得率。
10、能否使用TE(PH8.0)洗脱?
可以
11、可否使用小于30μl的洗脱液进行洗脱?
不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。
12、关于DNA片段大小与回收率的问题?
100bp-500bp,30-60%;500bp-4kb,80-95%;4kb以上,30-50%。
13、OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符?
从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260的值
14、吸光度纯度测定时应注意的问题
吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度,所以请用与洗脱液体相同的液体,对测量样品进行稀释和调零。
15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度?
在电泳过程中,DNA会与大分子 的多糖紧密的结合在一起,凝胶的种类和质量不同,DNA与之结合力也不同,只有凝胶充分溶解,DNA才能充分释放,否则,凝胶将与DNA一起沉淀下来,洗脱后将影响回收结果的纯度。