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外源DNA和质粒载体的连接反应筛选与操作步骤

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DNA连接与转化 质粒

DNA克隆 技术是70年代分子 生物学发展的重大成果,用限制性内切酶 直接切割分离某个外源DNA片段,与此同时用同一种限制性内切酶 切割载体 DNA,两个DNA产生同样的粘性末端,将它们混合后,二者的粘性末端通过碱基间氢键配对而互补。然后在T4DNA连接 酶作用下,使外源DNA片段和载体 连接而成为完整的重组 DNA分子

现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌 DNA的短区段,其中含有β-半乳糖苷酶基因的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。宿主的染色体 上带有β-半乳糖苷酶C端的编码序列。宿主和质粒 编码的片段各自都不具有酶活性,但它们可以结合为一体,形成具有酶活性的蛋白质。这样,质粒 载体与LacZ基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌 突变 体之间实现互补,这种现象称为α-β-D-半乳糖苷存在下形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后,将产生无α互补能力的质粒,由这种质粒转化的大肠杆菌形成白色菌落。

抗生素平板选择标记:

ppUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因,而JM109宿主菌对氨苄青霉素没有抗性。在用pUC19质粒转化JM109后,涂布到含有氨苄青霉素的培养基上培养,没有被转化的菌不能生长,而被转化了的菌可以正常生长,形成菌落。

β-半乳糖苷酶系统筛选(蓝、白斑筛选):

pUC19质粒带有一个大肠杆菌DNA的短区段, 其中含有β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。JM109宿主菌染色体上带有Lac Z的C端部分编码信息,它们编码的肽段各自都不具有酶活性, 但它们在同一细胞内可以通过非共价键结合起来, 形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。质粒载体与Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的大肠杆菌突变体之间的这种互补作用称为α互补。

1实验目的:

掌握CaCl2法将载体(质粒)转化入受体(大肠杆菌)的实验技术

2 实验步骤:

2.1 配选择培养基平板:

2.1.1 LB液体培养基: 1g蛋白胨, 0.5g酵母粉, 1g NaCl, 加重蒸水100ml,用NaOH调pH至7.0,高压灭菌。(每组配50ml)

2.1.2 LB固体培养基: 在40ml未高压灭菌的LB液体培养基中加1.5%琼脂 ,高压灭菌后取出。当培养基冷却到约50℃时,加入氨苄青霉素母液(500mg/ml),使其终浓度为200μg/ml,摇匀后迅速倒成两个平板。(高压灭菌同时也灭菌两套洗净的培养皿)

2.1.3 在超净工作台上,往倒好的每个平板培养基上涂布40μl X-gal贮备液(80mg/ml)和4μl IPTG贮备液(200mg/ml),将平板置于室温放置3-4h直至液体被吸收。

2.2 制备感受态细胞

2.2.1 取大肠杆菌JM109划线培养过夜的单菌落接种到20mlLB液体培养基中,置37℃摇床于280rpm振摇培养约6h。

2.2.2 将细菌 转移到一个无菌离心管中,冰上放置10min,使培养物冷却到0℃。

2.2.3 以4000rpm离心10min,回收细胞,弃上清,将管倒置使残留的痕量培养液尽量流尽。

2.2.4 以1.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀,放置于冰浴。

2.2.5 以2000rpm离心10min,回收细胞且使培养液流尽。

2.2.6 取1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞,将细胞分成200μl一份,装入Eppendorf管中,置4℃冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。

2.3 转化

2.3.1 取2管200μl的感受态细胞,1管中加入50 ng pUC19的DNA,另1管为不加质粒DNA的对照,轻轻旋转以混匀内容物,冰上放置30min。

2.3.2 将管放到42℃水浴中1.5min,不要摇。然后在冰浴中迅速冷却 2min。(热激反应)

2.3.3 每管加入100μl LB培养基,37℃水浴中温育45min。

2.4 培养

2.4.1 取200μl菌液加在含有氨苄青霉素及X-Gal和IPTG的选择平板培养基上,用一无菌弯头玻棒轻轻将细菌涂在琼脂平板表面,将平板置于室温直至液体被吸收。经质粒转化的细菌和未转化的对照各涂布一个平板。

2.4.2倒置平皿37℃培养12-16h,对照培养皿中应无菌落出现,涂布有经质粒转化细菌的培养皿中长出蓝色菌落。

2.4.3 第二天上午观察结果,记录现象,并大致估计各皿的菌落数。

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