DNA的连接策略

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DNA连接与转化

4.1 实验原理

4.1.1 DNA的连接策略

质粒 具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆 较小的DNA片段(<10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。

外源DNA片段和质粒载体 的连接反应策略有以下几种：

(1)互补性粘性末端的连接

单一限制性内切酶 或两种限制性内切酶 (为同尾酶，如BamHI和BglII)分别处理载体和外源DNA，得到的粘性末端为互补性突出末端，在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子 串连形成寡聚物，且正反两种连接方向都可能有。为了降低载体的自身环化，使正确的连接产物数量达到最高水平，一般载体DNA和外源DNA的分子 数比(浓度比)为1：3～1：10之间。同时，为了最大限度地抑制质粒DNA的自身环化，还可将载体DNA的5’磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，防止其自身环化。而带5’端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli 受体菌后该种缺口可在DNA复制 过程种自动修复。

(2)非互补粘性末端的连接

用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这DNA重组 中最容易克隆的DNA片段。一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。该种粘性末端的连接载体DNA和外源DNA的分子数比(浓度比)通常为为1：1。

(3)平头末端的连接

是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶 补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接 酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶 Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

4.1.2 DNA连接酶类型

能用于连接DNA的酶有2种：大肠杆菌 连接酶和大肠杆菌 T4噬菌体所编码的T4-DNA连接酶。前者的反应需要NAD+参与催化，而T4连接酶的反应则需要ATP参与催化。最初的研究表明，大肠杆菌连接酶只能催化粘端的连接，现在发现在PEG或聚蔗糖存在的条件下，也能进行平端的连接。相比较而言，T4-DNA连接酶并不需要PEG等的存在就能进行平端的连接，所以现在实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。

4.1.3 DNA连接的影响因素

连接反应的影响因素包括温度，时间，酶量，缓冲体系，DNA末端的性质(见4.1.1)及浓度，DNA片段的大小等。

(1)温度与时间

连接反应的一项重要参数是温度，理论上连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。一般粘性末端的连接在此温度下，反应30min即可取得较好的效果，如时间充裕的话连接60min则更完全些，为了实验方便有时也在4℃条件下连接过夜。而对于平头末端的连接，建议在37℃条件下连接，并且时间适当延长。

(2)酶量

酶单位的定义在宝生物工程公司提供的T4-DNA连接酶中是指在20ml的连接发应体系中，6mg的l DNA-HindIII的分解物在16℃下发应30min时，有90%以上的DNA片段进行连接的酶量为1U。由以上的定义可知，日常连接实验中的DNA的浓度比酶量定义的状态下低很多10～20倍，所以实际酶量是过量的。平头末端的连接酶的用量要比粘性末端连接所需酶量大10~100倍，因此厂商提供的连接酶浓度往往是高浓度的(宝生物的T4-DNA连接酶浓度350U/ml)。故从这个意义上分析，常规的粘性末端的连接反应体系中酶量的加入往往是过量的。

(3)缓冲体系

不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HCl(pH 7.5)提供连接所需的合适pH值。另外在缓冲液中还有两种主要成份非常重要：DTT和ATP。前者提供一定的还原能力，而后者能促进连接反应的有效进行。但是在实验中缓冲液使用时的反复冻融会引起ATP的分解，从而影响连接效率。为了保证实验的顺利进行，一般大剂量的缓冲液可以分装成小管保存并使用，另外可考虑使用一段时间的缓冲液定期更新一下。

(4)DNA浓度

DNA连接反应中建议的DNA连接浓度为0.1~1pmol/ml，，而为了降低载体分子间的环化，载体DNA的浓度不宜过高，外源DNA的投入量则依据连接类型不同投入1～10倍。

4.2 试剂与器材

1. 试剂 (1)外源DNA和载体DNA

(2)T4-DNA连接酶

2. 器材 (1)eppendorf 管、枪头

(2)移液器

4.3实验步骤

4.3.1 常规DNA分子的连接

(1)用适当限制酶消化载体质粒和外源DNA，必要时用琼脂 糖凝胶电泳 分离片段。

(2)载体DNA取A ml，外源DNA取B ml，充分混匀后于42℃保温10分钟后，迅速冷却到0℃(可省略，热脉冲是为了提高两种DNA分子碰撞的概率)。

(3)再按设计的反应体系依次加入：10×T4-缓冲液，T4-DNA连接酶。

(4)置于16℃连接1h以上，待用。

建议连接体系(可根据样品浓度进行适当调整)：

ddH2O(ml) 外源DNA(ml) 载体DNA(ml) Buffer(ml) Enzyme(ml) Total(ml)

13-A-B B A 1.5 0.5 15

4.3.2 PCR产物与T-载体连接

(1)回收的PCR扩增产物直接与pMD18-T载体连接，连接反应按如下：

5×Buffer pMD18-T PCR产物 T4-DNA ligase ∑

2ml 0.5ml 7ml 0.5ml 10ml

(2)16℃连接1h以上，用于转化。