TOPO克隆 “飞”一般的感觉

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还在为分子克隆一个实验循环漫长的等待时间而苦恼吗?克隆一回要多久?七天?两天?一天?那你就out了。1997年Invitrogen 公司推出的TOPO克隆早就颠覆了之前的一切。这场克隆的革命使得TA克隆、PCR克隆或者其他的克隆都实现了突破，是的!5分钟就够了!

TOPO载体 的种类还在不断增加，应用范围包括普通的亚克隆、测序、体外转录和表达等。TOPO克隆的核心是DNA拓扑异构酶I，它同时扮演了限制性内切酶和连接酶两个角色。它的生物功能是在复制过程中切断并重新连接DNA。牛痘病毒拓扑异构酶I特异性地识别5’-(C/T)CCTT-3’序列，与3’T的磷酸基团形成共价键，并切断一条DNA链，使DNA解链。随后它从DNA末端撤离。为了利用拓扑异构酶的连接活性，TOPO载体被线性化，并在每个3’磷酸基团上连接了拓扑异构酶I。这样能确保载体与互补末端的迅速连接(图1)。整个连接过程只需要5分钟，就是这么简单。

如果你用的是TOPO版的TA克隆，那么基本过程与TA克隆相似，注意事项可以参考TA克隆的策略。唯一不同的是连接过程。首先是离子浓度。Invitrogen的实验证明高盐浓度(200 mM NaCl、10mM MgCl2)能使转化子增加2-3倍。因为盐能够防止拓扑异构酶I在连接之后，重新结合模板并切割DNA。结果产生了更多完整的重组 子，转化效率自然也提高了。不过电转所需的盐浓度比化学转化低，这一点要特别注意。其次是连接时间。对于大部分实验来说，5分钟已足够。如果PCR产物大于1 kb，将连接时间延长至30分钟能产生更多的克隆。最后强调一下反应温度。T4连接酶不能超过16℃，而拓扑异构酶I则偏爱室温。这个室温是指22-23℃，应特别注意。很多时候我们实验室的室内温度并不满足条件。TOPO克隆得到的菌落可能不如TA克隆多，不过质量高，95%左右都是重组子。价格约为5748元/20次，时间就是金钱，这下体会到了吧。

如果你用的是高保真酶，你可以选择在PCR之后加A，或者你直接选择平端克隆试剂盒。由于载体会自连，所以平末端克隆的背景会很高。为了避免这个问题，Invitrogen开发了Zero Background(零背景)技术，用在TOPO载体上。这个技术将LacZa和致死的ccdB基因串联在一起。如果载体自连，ccdB基因表达，菌落就无法生长;如果插入片段，ccdB基因的表达被破坏，重组 子才得以生长。这样，就避免了平端克隆的高背景，使重组效率达到95%以上。这个试剂盒的价格更贵一些，20次的是6240元。

TA克隆以其简单快速而深得人心，不过有利即有弊。TA克隆无法定出方向，重组 子中正反方向的约各占一半。如果仅仅是克隆也无所谓，表达可就不能这么随便了。因此TOPO系列也推出了定向克隆的版本，简称为D-TOPO。在这个系统中，克隆载体的一端有着GTGG的垂悬。PCR的正向引物上也添加了CACC四个碱基。这样，通过碱基互补配对，就锚定了PCR产物处于正确的方向。而克隆效率也在90%或以上。引物设计也不麻烦，只需在正向引物的5’端加上CACC四个碱基即可。不过反向引物的末端可一定不能与GTGG配对，否则前功尽弃。仅仅只有一个错配也不行，克隆效率会从90%降到50%。为保险起见，最好能与GTGG保持两个碱基以上的错配。D-TOPO主要用在表达载体上，价格约在4000-6000元不等。

以往的TOPO克隆市场总是Invitrogen一家独大。前两年Strategene公司也推出了5分钟的StrataClone技术，与之抗衡。StrataClone的原理与TOPO克隆类似，但也不完全相同，估计是专利的问题。它也是利用了牛痘病毒的拓扑异构酶I的连接功能。不过载体分成了两段，每一段的一端连着拓扑异构酶I和U尾巴，另一端则包含loxP识别序列。PCR产物通过A-U互补而形成一条线性分子(载体臂-PCR产物-载体臂)。这时转化进表达Cre重组酶的感受态细胞。在Cre重组酶的作用下，loxP位点发生重组，产生可复制的环状分子。这个过程似乎要稍微麻烦一些，而且对感受态细胞还有要求，一定要表达Cre重组酶。我们常用的TOP10、JM109等就不能用了。不过它胜在价格便宜，20次的价格为4084元，还经常打折。

不花钱购买新载体，也一样能实现5分钟的克隆。NEB公司的快速连接试剂盒就不可小觑。它其中的T4连接酶浓度竟然高达2000 U/ul，是其他厂家的400倍。因此连接效率也陡然上了一个新台阶，从原先的过夜孵育缩短到5分钟。使用的时候一定要注意了，不要觉得时间太短，自作主张延长一会儿，其实根据NEB专家的研究，延长时间并不会带来积极的作用。事实上，2小时以后连接效率反而开始下降，过夜连接会使效率下降75%。这个试剂盒的价格是1009元/30次，相对于上面那些大牌来说，这个价格很亲民吧。不过它只含有T4连接酶和buffer，载体和感受态细胞就不包括在内了。

了解了TOPO克隆了吧，是的!5分钟!5分钟就够你做一个克隆。科技方法的进步使得实验变得快捷高效，而且我们相信一切还会进步，期待着总有一天可以一分钟甚至是几秒钟就完成克隆。