专家建议：从FFPE样品中提取DNA的小技巧（上）

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世界上绝大多数的组织样品是使用福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)的方法处理的。要想提取出其中的核酸信息，相当有难度，因为FFPE样品中的DNA和RNA已经部分降解了，且DNA往往与组蛋白紧密交联。但是这个领域的科学家们也不是等闲之辈，他们近几年已经摸索出了更有效的方法。在此，收集了多位专家在这方面的建议和小窍门，供您参考。现在，让我们来听听专家是如何说的。如果您在这方面有独特的心得体会，也欢迎与我们分享。

我们要讨论的四个问题如下：

Q1：Do you pre-treat your samples prior to extraction?

Q2：What extraction method do you use to isolate DNA from the tissue? How long do you incubate and what buffer do you use?

Q3：How do you optimize the efficiency of DNA extraction? What do you consider a good yield?

Q4：How do you determine the quality of the DNA extracted? What degree of fragmentation is acceptable?

问题一：在提取前需要预处理样品吗?

Sunil Badve 印第安那大学药学院

除了在最低温度融化石蜡外，我们什么也不做。

MARK Bouzyk 爱默里大学(EMORY UNIVERSITY)药学院

我们通常收集5um切片，放入2ml螺旋管中。一般每次处理3-6个切片。有时候我们也用1mm组织芯。开始，我们用二甲苯在50度处理3分钟，去除切片上的石蜡，然后用乙醇洗涤两次去除二甲苯。

Susan Long 俄亥俄州立大学医学院

玻片用二甲苯脱蜡，再用乙醇漂洗后，取10um未染色切片。风干后用手术刀刮下来浸在消化液中，然后放入装有Qiagen ATL缓冲液和蛋白酶K溶液的试管中。

Jeffrey Mason 美国国防病理中心

对于FFPE组织切片，有两种预处理方法。第一种方法是，将这些组织(10-50mm切片)用二甲苯孵育，再用浓度逐步降低的乙醇洗涤(100%、90%、70%)，再用PBS 缓冲液水合。这个步骤也略有不同，比如乙醇的浓度或1M硫氰酸钠水合过夜。第二种方法是，将这些组织(10-20mm切片)置于缓冲液中，在120度孵育20分钟，然后冷却到室温。缓冲液包含28.6mM的柠檬酸、磷酸钾、硼酸和巴比妥，用NaOH调节pH值到9。这种预处理的方法还能使你省去下面DNA提取过程中的酶消化步骤。

问题二：你使用哪种方法从组织中提取DNA?孵育多久?使用的是哪种缓冲液?

Sunil Badve印第安那大学药学院

我们用的是Qiagen的DNeasy，或类似的产品。

Carol Barone 杜邦儿童医院

我们将FFPE样品切割成10um大小，放在eppendorf 管中，而不是把样品磨碎。分子诊断实验室向管中加入300ul histo-clear来脱蜡(室温5-10分钟)，并离心。重复三次，抛弃histo-clear和石蜡。用100%乙醇室温水合。离心，倒出乙醇，重复三次。再加入300ul裂解液、1.5ul蛋白酶K，孵育3小时。在必要时重复或孵育过夜。分子诊断实验室用的是Gentra的操作步骤，唯一的不同是切割样品而非磨碎。

Mark Bouzyk爱默里大学(EMORY UNIVERSITY)药学院

样品脱蜡后，我们就会消化DNA上的结合蛋白。由于DNA往往会与组蛋白紧密交联，我们推荐用Ambion的蛋白酶和消化液在50度孵育至少48小时。我们试过许多试剂盒和操作步骤，觉得还是Ambion的RecoverAll Total Nucleic Acid Extraction Kit比较好用。对于DNA的分离和纯化，我们利用的是Ambion专利的分离液和过滤器 ，洗涤和洗脱液，并按照它们的步骤操作。整个手工操作过程约为45分钟。如果是高通量分析，RecoverAll MagMAX Custom Kit可能更为理想。

Susan Long俄亥俄州立大学医学院

我用的是Qiagen的QiaAMP DNA Micro Kit来分离DNA。首先用QiaAMP ATL消化液和蛋白酶K溶液在65度孵育样品，至少是过夜，最长可达48小时。然后在提取前再加入一定量的蛋白酶K，并孵育几小时。

Jeffrey Mason美国国防病理中心

从FFPE样品中提取DNA的最关键步骤就是消化蛋白。蛋白酶K是最常用的蛋白酶。消化/裂解缓冲液中通常是含有10-20 mg/ml蛋白酶K的Tris缓冲液。一般还会添加10%的SDS。组织置于消化液中，在55度孵育24小时，然后95度5分钟失活蛋白酶。

再将酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)加入消化液中，通过离心回收上清。然后再在上清中加入氯仿，并离心，小心去除上层的水相。再加入小体积的3M 醋酸钠和异丙醇沉淀DNA。如果DNA的量很少，还可以加入糖原帮助沉淀。沉淀的DNA用乙醇洗涤，干燥，用20ul或50ul水或缓冲液来溶解。要想使DNA完全溶解，可能需要孵育过夜。（待续）