实验一,Total RNA的提取
1.试剂配制
准备工作:
1,研钵,5ml/10ml/ 25ml移液管,100ml/250ml量筒,250ml/100ml容量瓶,药匙, 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时.
2,50ml/1.5ml离心管,枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃ 20mins 高压灭菌.
电泳槽及电泳托,梳子用3%双氧水处理.
4,常用试剂及其配方:
▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌.
▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5
三水合柠檬酸纳 22.94g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.
▲10%肌氨酸钠:
肌氨酸钠 10g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.
▲变性裂解液:
0.78M柠檬酸钠 8.25ml
10%肌氨酸钠 12.375ml
异硫氰酸胍 118.05g
加DEPC水定容至 250ml,室温放置备用
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)
▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5
NaAc·3H2O 13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
▲3M醋酸钠 PH=5
NaAc·3H2O 20.4g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
4M LiCL:
LiCL 24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用
▲0.5M EDTA PH=8.0
EDTA 18.61g
用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用
▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):
MOPS 41.86g
NaAC·3H2O 4.10g
0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml
用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用.
1x MOPS:
10x MOPS 30ml
加DEPC水270ml,用时现配.
▲4x RNA Loading buffer:
10x MOPS 400ul
甘油(高压过) 200UL
溴酚兰 10ul
甲醛(37%) 72ul
去离子甲酰氨 310ul
EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul
ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul
在4℃ 可保持3个月
10x PBS
pH=7.4
NaCl 80g
KCl 2g
Na2HPO4 14.4g
KH2PO4 2.4g
定容至 1000ml
▲变性电泳胶:
称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上.
▲变性电泳缓冲液:
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml
实验二,动物组织total RNA的提取
根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟.
将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片.
根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次.
根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.
冰浴10分钟.
4C,12000g离心20分钟.
小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA.蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层.
加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上.
4C,12000g离心20分钟.
根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA.
加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.
4C,12000g离心20分钟.
小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟.
4C,12000g离心20分钟.
弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀.4C,12000g离心10分钟.
弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味.用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀.
取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存.
Mg# of tissue
变性裂解液(ml)
2M NaOAC pH 4 (ml)
水饱和酚 (mL)
氯仿 (mL)
异丙醇(mL)
变性裂解液 (mL)
异丙醇(mL)
75% 乙醇(mL)
DEPC-treated H20 (mL)
500
5
0.5
5
1
4
0.5
0.5
1
0.5
800
8
0.8
8
1.6
6
0.8
0.8
1
0.8
1000
10
1
10
2
8
1
1
1
1
实验三,植物组织total RNA的提取
先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状.
将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆.(1g样品加入3ml变性裂解液).
加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀.
加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡.
冰浴10min.4℃,12000g离心10min
小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时.
4℃,12000g离心20min.
去上清,取沉淀.加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中.
4℃,13000rpm离心15min.
用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀.
4℃,13000rpm离心10min.
取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上.
4℃,13000rpm离心15min.
弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min.
弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味.
用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀.
取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存.
4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)
查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%.
将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片.
3.室温温育10分钟 .
据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟.
4 C,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%.
转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中.根据表2加入适量异丙醇,-20 C沉淀1小时以上. (责任编辑：大汉昆仑王)
