Tricine-SDS-PAGE胶的使用方法

Tricine胶比较容易将样品压平，具体原因我也没有搞清楚，但可以肯定的是这种胶跑出来的Marker又细又直，同样，显出来的条带也压的很好。与普通的SDS-PAGE胶跑出来的结果相比，Marker扩散没有那么厉害，各泳道条带间隔明显，不像普通胶的条带容易连到一起。反正跑出来的条带就是很漂亮。

Tricine-SDS-PAGE胶的配方：（我一直用的就是10%这个浓度，把8KD和280KD都做出来了）
分离胶 积层胶
ddH2O 1.85 mL 2 mL
AB-3 1 mL 250 uL
Gel-Buffer(undefined) 1.65 mL 750 uL
甘油 0.5 mL —
10%AP 25 uL 22.5 uL
TEMED 2.5 uL 2.25 uL
(这个配方来自DXY，今天又回来了，呵呵)

undefinedGel-Buffer 配方：(200mL量)
Tris-Base 48.44g
Tris-HCl 31.52g
SDS 0.6 g 
pH 8.45,很难溶，可以60°C水浴促进溶解。

AB-3 (100mL量)
丙烯 48g
双叉丙烯酰胺 1.5g
注意：丙烯溶解后会使溶液体积增大，故只要用约80mL水溶解即可，完全溶解后再定容。通风橱内操作，注意保护自己！

外槽电泳液（+极）（Anode Buffer）1undefined
Tris-Base 46.92g
Tris-HCl 17.73g
500mL体积，pH 8.9。

内槽电泳液（-极）（Cathode Buffer）1undefined
Tris-Base 24.22g
Tricine 35.84g
SDS 2g
200mL体积，pH 约8.25。

（内外槽电泳液的体积这样配，是因为一般电泳槽内槽一次只要150mL液体，而外槽需要400-500mL液体。）

 

　　制胶时，分离胶做好后加水压平，一般20min就凝固了。为了避免样品漏的问题，可在分离胶凝固后（表现为分层处出现一条清晰的分界线），这时候，可以不急着把水控干，而是配置积层胶，但是AP和TEMED先不加，再空出水（枪头沿一边吸尽即可），再在积层胶里加入AP,TEMED，迅速混匀，先取少量胶液灌入板内，轻轻摇晃几下，润一遍，弃掉这些胶液，这时候尽量去干净，动作要快。再正式灌满胶液，插上梳齿。
　　跑电泳时，可以60V先压约30min，可以看到溴酚蓝变的又细又直，待进入分离胶，可以看到预染的Marker已经分离，就可以将电压调至120V跑完。
　　转膜与普通的都一样，这里建议30V恒压转2小时(用于80KD以下的蛋白分子），如果有更大的蛋白280KD的mTor,可以再这2h后再加350mA 30min，效果很好，280KD以下90KD以上的都可以加350mA这一步，时间根据分子量来定。90KD加15min即可。