MTT所有问题大汇总
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实验前应明确的问题
1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD 值，输入excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4. 培养时间。200ul 的培养液对于10 的4~5 次方的增殖期细胞来说，很难维持68h ，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在48h 换液的。
5. MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT 比色OD 值的升高。
6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT 、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT 、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8. 避免血清干扰。用含15% 胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10% 胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤
贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul ，铺板使待测细胞调密度至1000-10000 孔，（边缘孔用无菌PBS 填充）。
2. 5%CO2 ，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般5-7 个梯度，每孔100ul ，设3-5 个复孔. 建议设5 个，否则难以反应真实情况
3. 5%CO2 ，37 ℃孵育16-48 小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入20ulMTT 溶液（5mg/ml ，即0.5%MTT ），继续培养4h 。若药物与MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS 冲2-3 遍后，再加入含MTT 的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min ，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm 处测量各孔的吸光值。
7. 同时设置调零孔（培养基、MTT 、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT 、二甲基亚砜）
悬浮细胞：
1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1 ×106/ml ，按次序将①补足的1640 （无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D （有毒性）10ul 用培养液稀释 （储存液100ug/ml ，需预试寻找最佳稀释度，1 ：10-1 ：20 ）；③需检测物10ul ；④细胞悬液50ul （即5 ×104cell/ 孔），共100ul 加入到96 孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ul 1640 ）。
2. 置37 ℃，5%CO<font>2</font> 孵育16-48 小时，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入10 ul MTT 溶液（5 mg/ml ，即0.5%MTT ），继续培养4 h 。（悬浮细胞推荐使用WST-1 ，培养4 h 后可跳过步骤4 ），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm 校准）测量各孔的吸光值）
4. 离心（1000 转x10min ），小心吸掉上清，每孔加入100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min ，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm （630nm 校准）测量各孔的吸光值。
5. 同时设置调零孔（培养基、MTT 、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT 、二甲基亚砜），每组设定3 复孔。
MTT的配制
MTT 一般最好现用现配，过滤后4oC 避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT 粉分装在EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT 有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套. 配成的MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感；往96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT 时用用PBS 溶解，也有人用生理盐水配，60 ℃水浴助溶。
PBS 配方： (责任编辑：大汉昆仑王) |
