碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们.在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起.当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成 状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去.
[仪器,材料与试剂]
仪器
恒温培养箱
恒温摇床
台式离心机
高压灭菌锅
材料
1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA)
4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠(SDS)
6.乙酸钾
7.冰乙酸
8.乙醇
9.盐酸(HCl)
10.Bt菌株
11.吸头,小指管
试剂
溶液I
50mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris・HCl
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
溶液II
0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合
溶液III
5mol/L乙酸钾 60mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE缓冲液
10mmol/L Tris・HCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)
STEP:
1.将Bt菌株接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜.
2.取1ml培养物倒入Eppendorf管中,12000r/min离心30sec.
吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥.
3.将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡.
4.加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧管皿,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf管放在冰上.
5.加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min.
6.12000r/min,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中.加入等体积的酚－氯仿离心１０分钟．
７.向上清夜加入１／１０体积的醋酸纳，2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5~10min.12000r/min离心5min.倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体.
８.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清夜,真空抽干或空气中干燥.
10,50μL TE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存.
重点说明:ＳＴＥＰ４中加入溶液２后一定不要放冰上，否则实验就回失败．室温静止３min即可．
ＳＴＥＰ５可静置也可直接离心．７中加2倍体积乙醇后最好－２０度过夜．也可用异戊醇静置１５－－２０min
12000r/min离心１０min．８中可以将沉淀置７０度烤箱２min．这样整体实验可以缩短好多时间．
好多的参考书上都写道：加入溶液２后冰上５分钟，实际上书上错了，照着书上做是不会有结果的，本人提质粒有
半年了，刚开始怎么也做不错了，后来经过调整步骤，结果非常好，希望本人辛苦半年摸索的经验与大家分享，如果有兴趣不妨试试，会让你喜出望外的
(责任编辑：大汉昆仑王)
