DNA重组与基因工程--　工具酶

 

第二十章　DNA重组与基因工程

DNA Recombination and Genetic engineering

基因工程(genetic engineering)和遗传工程的英语中是同一个词汇。从字面上看,遗传工程就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。遗传是由基因决定的，改建生物的遗传性，就是改建生物的基因，因此狭义的遗传工程就是基因工程。

对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNa recombination）。

图20－1　基本工程的基本程序

重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以DNA重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名词。

只有当人类对遗传现象本质和规律有深入的认识，才能按人类的意志去改造或创建生物的遗传特性。20世纪50-60年代分子遗传学的迅速发展，确定了主要遗传物质DNA的双螺旋结构、阐明了遗传信息传递的中心法则、破译了遗传密码，为基因工程奠定了理论基础；同时酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的工具。1972-1973年Boyer、Cohn和Berg等创立了DNA克隆技术，打破了种属的界限，第一次使本来只存在于真核细胞中的蛋白质能够在大肠杆菌中合成，这是基因工程诞生的里程碑。科学界公认基因工程的出现是20世纪最重要的科学成就这一。标志人类主动改造生物界的能力进入新的阶段。分子生物学的成就是DNA重组技术和基因工程出现和发展的基础，而DNA重组技术和基因工程的发展又有力地推动着分子生物学的进步。

基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。如无特别说明，通常生物技术一词就专指新的生物技术而言。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程（protein engineering）则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。

基因工程的基本程序见图20-1所示。

第一节　工具酶

DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具，表20-列出最常用的几种工具酶。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此较详细介绍。

一、限制性核酸内切酶的概念

核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。

二、限制性核酸内切酶的命名

按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。

三、限制性核酸内切酶的分类

按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：

Ⅰ类限制性核酸内切酶　由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。

Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。

Ⅲ类限制性核酸内切酶　只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。

表20-1 DNA重组技术中最常用的工具酶

酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶Ⅰ

或其大片段（Klenow） ①缺口平移制作标记DNA探针

②合成cDNA的第二链

③填补双链DNA3’凹端

④DNA序列分析 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） 聚合酶链反应（PCR） DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 末端转移酶 在3’末端加入同质多聚物尾 SI核酸酶，绿豆核酸酶 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 DNA端酶Ⅰ 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解除RNA 磷酸酶 切除核酸末端磷酸基

四、限制性核酸内切酶的作用

大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：

①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例：

5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp　OHTTAAC…3’

3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'…　 CTTAAOH　 pG…5'

②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：

5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp　OHG…3’

3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH　pACGTC…5

③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例：

5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’

3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOh pGCT…5’

不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同。有的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb或65kb出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。

限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近800多种，可以根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供了有力的工具。表20-2列出了几种最常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点。

表20－2　几种最常用的限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶名称

识别序列和切割点 BamHⅠ

Cla Ⅰ