物细胞的脱分化和分化培养

一、实验原理
分化了的植物根、茎、叶细胞往往具有全能性，在一定条件下进行离体培养，给于一定的营养与激素，可以脱分化为愈伤组织，由愈伤组织制备成细胞悬浮液，在一定的条件下经振荡培养，逐渐形成具有两极性的胚状体，经过进一步的分化培养，给于不同的营养和激素成分，又可以生出完整的小植株。植物的脱分化和分化培养，证明分化了的植物细胞仍具备形成全整植株所需要的全套基因。在一定条件下，活动的基因可以关闭、已关闭的基因又可以重新启动、再行由胚到成熟植株发育过程中有关基因的先后活动程序。
二、实验目的
1.通过实验，掌握无菌操作方法，将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。
2.用无菌操作方法，把烟草组织或甘蓝花茎直接培养成分化小植株。
三、实验材料
胡萝卜贮藏根每组二根，甘蓝花茎或烟草茎每组二根。
四、实验器具和药品
每组铝饭盒3个，大培养皿2套，250毫升烧杯2只，漂白粉过滤液200毫升，70％酒精，酒精棉花，镊子2把，保安刀2把，小镊1把，无菌水。
脱分化培养基各组6瓶，30毫升/瓶
分化培养基各组4瓶，30毫升/瓶
MS培养基：每升中含

固体培养基：MS液体加0.8％ 琼脂
脱分化培养：MS培养基加2，4－D2毫克/升
BA0.2毫克/升
分化培养基：1.MS培养基加KT（或BA）2毫克/升
2.MS培养基加KT（或BA）2毫克/升+IAA0.05毫克/升
其中KT为激动素、BA为6-苄基嘌呤、IAA为吲哚乙酸（2种分化培养基，采用一种即可）
五、实验说明
脱分化培养基和分化培养基的主要区别在于 激素 的成分和含量上，说明各种 激素 的出现和含量改变对于植物组织分化起着重要的作用。许多植物从脱分化到分化过程对培养基里激素成份要求严格、有的还要进行液体培养才能重新分化。例如，胡萝卜贮藏根组织，是最早用于研究植物细胞的全能性的材料，至今仍是研究脱分化的好材料，但当胡萝卜组织形成愈伤组织之后，若要它们重新分化，必须经过振荡培养和采用合适的培养基，条件较为复杂。另一些植物，例如烟草的根、茎、叶和甘蓝的花茎等容易进行脱分化和分化培养，不需液体振荡培养可以在固体培养基上直接完成，是两类较好的实验材料。
六、实验步骤
（一）操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，尽量做到不带菌。
（二）将事先用自来水洗净的烟草茎，甘蓝花茎或胡萝卜贮藏根切成一定的大小（一般茎、根约为2厘米长、宽）。
（三）完成以上步骤后，又应用70％酒精棉花擦手，以便再行消毒。
（四）用消毒镊子将根或茎的切段投放到装有70％酒精的大培养皿中浸泡30秒钟。
（五）切段自酒精中取出后，立即浸泡于装有15％漂白粉精片水溶液的大培养皿中达20秒钟。
（六）以上组织切段经分别装有无菌水Ⅰ、Ⅱ的铝饭盒各10分钟，进行漂洗，最后置于无菌水Ⅲ中达20分钟以上。
（七）切段自无菌水中取出后，立即放于9厘米灭菌培养皿中，盖上皿盖，放于灭菌接种箱。
（八）在灭菌箱中，无菌操作，削去植物茎、根的外部，叶子的边缘。
（九）把正常部分切成3mm×3mm×1.5mm大小方块，叶组织切成1.5cm×1.5cm方块。
（十）由小镊子和接种针，在无菌条件下，将组织小块放入盛有脱分化培养基的三角烧瓶中，每瓶放5—6茎，根组织块或3—4块叶片组织块。挂上标签，写明日期，组号。
（十一）20℃—25℃避光培养3—4星期后观察。
（十一）烟草或甘蓝的花茎、长成的愈伤组织，可用同样的无菌操作法，再接种到分化培养基上，3—4星期再进行观察。
胡萝卜材料要经过液体培养基振荡培养，才能分化（本实验从略）。
七、实验结果
（一）观察并记录接种的脱分化培养的组织细胞有无污染？
（二）愈伤组织细胞是否出现绿色？讨论其来源与影响？
（三）烟草组织或甘蓝花茎经过分化培养、长出完整的植株，说明什么问题？在理论和实践中有何价值？