昆虫病原微生物——细菌染色技术及形态观察
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1835
目的要求：
昆虫病原微生物的鉴定是昆虫病理学研究的重要范畴，是微生物防治害虫中不可疏忽的步骤。对昆虫传染病的认识和致病原因的确定均取决于对病原微生物的正确鉴定，而且直接关系到病原体的生产、剂型和使用。
本实验要求通过显微镜检查和细菌学上的几个鉴别染色法来学习掌握鉴定细菌的常规方法，达到提高识别细菌形态的能力，和掌握鉴定细菌的技能。
二、实验 仪器 ：
玻片、酒精灯、接种环、香柏油、擦镜纸、二甲苯、显微镜、火柴、洗液瓶、镊子
供鉴定菌株：8010、7216、HD-1、140、009、021、E-3、016、023、087、010、096、012、013、B-Hm18、8311。
三、实验内容：
1.格兰氏染色：
溶液A：溶解4克结晶紫（包含90%）于40ml的95%乙醇中。
溶液B：溶解1.6 克草酸铵于160ml蒸馏水中。
混合A、B液，用前混合液要放置48小时。
路哥氏液：先溶解2克碘化钾于5ml的蒸馏水内。后加碘1克使溶解，再加295ml蒸馏水。
复染剂：加2.5%的藏红乙醇（95%）溶液20ml于200ml的蒸馏水中。
步骤：涂片火焰干燥，后用草酸铵结晶紫染1分钟，水冲洗5秒，然后用路哥氏碘液冲洗1分钟，水洗5秒，湿片用正丙醇换浸3次，每次1分钟，水冲洗5秒。也可用95%乙醇处理0.5分钟1次，以代替正丙醇。藏红复染液冲洗1分钟，最后水冲洗1分钟，凉干镜检。
结果格兰氏阳性菌染成紫色，格兰氏阴性菌染成红色。注意很多细菌对格兰氏反应常有京华，特别是较老的菌种。最好是用培养8~16小时的菌种，一般不超过24小时。此实验的染料配方很多，但成功与否，主要决定于经验。应同时在同一玻片上设有阴阳对照。
经典的染色法是丹麦，医生草革兰氏所发明，他在1884年报告了这个方法是作为在组织切片中使细菌着色的步骤。该法已沿用了100年。最近，美国加州大学和贵州农学院植保系都分别找到了一种极为简便，结果准确可靠的方法。该法是在干净的载玻片上滴上一滴3%的NaOH或KOH,用火柴杆或牙签挑取PDA平板上培养24~48小时的待测干菌干滴液里，迅速用火柴棍将菌与滴液调匀，边调边将火柴棍用上抬起。凡G - 在液滴中均变笛，并在火柴棍离开玻片时形成粘稠丝。而G - 无论用多大菌量与1滴NaOH溶液混合均不增加粘性，更不会形成粘稠丝。该方法对老菌株和新菌株均有效，但使用老菌株时量要用得多一点。值得注意的是NaOH + 相当于G ++ ，NaOH - 相当于G + 。
2.芽孢染色：
此法适用于区分细菌的芽孢和营养细胞。涂片自然干燥，火焰固定后，以5%孔雀绿水液浸染并蒸热10分钟，蒸时可将玻片置于酒精灯火焰上徐徐加热至染色剂溶液开始冒气但不煮沸腾，加热时可随时加注数滴染色剂于载玻片上，以免染剂蒸干，后来水冲洗30秒，用番红复染15秒水冲洗30秒。凉干镜检，结果芽孢染成绿色，营养细胞为红色。
3.晶体染色：涂片火焰干燥，用苯酚品红染1分钟，水洗，凉干镜检，结果晶体染成紫色，芽孢为透明椭圆形，仅见具有轮廓的折光体。
观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小。
4.鞭毛染色：
染液配方很多，有赖夫生染色法、银盐染色法，西萨——基尔染色法等。一般以西萨——基尔（Cesares-Gill）染法效果最佳。
媒染剂：单宁10克 Alcl 3 6H 2 O 1.8克
Zncl 2 10克 碱性品红花 1.5克
酒精（40%）40ml
研钵中盛酒精10ml,加上以上各种成分。充分研磨混合后，再加入多余的酒精，使用前用蒸馏水稀释2倍。染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。
染液：碱性品红花 0.3克 苯酚 5克
酒精（95%） 10ml 蒸馏水 95ml
溶液Ⅰ和溶液Ⅱ分别配制后混合。
步骤：斜面培养10~12小时的苏云金杆菌 试管 中加入无菌水，半个小时后，用接种环在洁净玻片上点上9环，自然凉干，用媒染剂染5~7分钟，轻轻用水冲洗。苯酚品红染色5分钟后水洗，凉干待检。
注意：鞭毛染色时涂片不能用火焰固定，否则受热后鞭毛蛋白变性，鞭毛收缩，无法看到。
昆虫病原微生物的鉴定是昆虫病理学研究的重要范畴，是微生物防治害虫中不可疏忽的步骤。对昆虫传染病的认识和致病原因的确定均取决于对病原微生物的正确鉴定，而且直接关系到病原体的生产、剂型和使用。
本实验要求通过显微镜检查和细菌学上的几个鉴别染色法来学习掌握鉴定细菌的常规方法，达到提高识别细菌形态的能力，和掌握鉴定细菌的技能。
二、实验 仪器 ：
玻片、酒精灯、接种环、香柏油、擦镜纸、二甲苯、显微镜、火柴、洗液瓶、镊子
供鉴定菌株：8010、7216、HD-1、140、009、021、E-3、016、023、087、010、096、012、013、B-Hm18、8311。
三、实验内容：
1.格兰氏染色：
溶液A：溶解4克结晶紫（包含90%）于40ml的95%乙醇中。
溶液B：溶解1.6 克草酸铵于160ml蒸馏水中。
混合A、B液，用前混合液要放置48小时。
路哥氏液：先溶解2克碘化钾于5ml的蒸馏水内。后加碘1克使溶解，再加295ml蒸馏水。
复染剂：加2.5%的藏红乙醇（95%）溶液20ml于200ml的蒸馏水中。
步骤：涂片火焰干燥，后用草酸铵结晶紫染1分钟，水冲洗5秒，然后用路哥氏碘液冲洗1分钟，水洗5秒，湿片用正丙醇换浸3次，每次1分钟，水冲洗5秒。也可用95%乙醇处理0.5分钟1次，以代替正丙醇。藏红复染液冲洗1分钟，最后水冲洗1分钟，凉干镜检。
结果格兰氏阳性菌染成紫色，格兰氏阴性菌染成红色。注意很多细菌对格兰氏反应常有京华，特别是较老的菌种。最好是用培养8~16小时的菌种，一般不超过24小时。此实验的染料配方很多，但成功与否，主要决定于经验。应同时在同一玻片上设有阴阳对照。
经典的染色法是丹麦，医生草革兰氏所发明，他在1884年报告了这个方法是作为在组织切片中使细菌着色的步骤。该法已沿用了100年。最近，美国加州大学和贵州农学院植保系都分别找到了一种极为简便，结果准确可靠的方法。该法是在干净的载玻片上滴上一滴3%的NaOH或KOH,用火柴杆或牙签挑取PDA平板上培养24~48小时的待测干菌干滴液里，迅速用火柴棍将菌与滴液调匀，边调边将火柴棍用上抬起。凡G - 在液滴中均变笛，并在火柴棍离开玻片时形成粘稠丝。而G - 无论用多大菌量与1滴NaOH溶液混合均不增加粘性，更不会形成粘稠丝。该方法对老菌株和新菌株均有效，但使用老菌株时量要用得多一点。值得注意的是NaOH + 相当于G ++ ，NaOH - 相当于G + 。
2.芽孢染色：
此法适用于区分细菌的芽孢和营养细胞。涂片自然干燥，火焰固定后，以5%孔雀绿水液浸染并蒸热10分钟，蒸时可将玻片置于酒精灯火焰上徐徐加热至染色剂溶液开始冒气但不煮沸腾，加热时可随时加注数滴染色剂于载玻片上，以免染剂蒸干，后来水冲洗30秒，用番红复染15秒水冲洗30秒。凉干镜检，结果芽孢染成绿色，营养细胞为红色。
3.晶体染色：涂片火焰干燥，用苯酚品红染1分钟，水洗，凉干镜检，结果晶体染成紫色，芽孢为透明椭圆形，仅见具有轮廓的折光体。
观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小。
4.鞭毛染色：
染液配方很多，有赖夫生染色法、银盐染色法，西萨——基尔染色法等。一般以西萨——基尔（Cesares-Gill）染法效果最佳。
媒染剂：单宁10克 Alcl 3 6H 2 O 1.8克
Zncl 2 10克 碱性品红花 1.5克
酒精（40%）40ml
研钵中盛酒精10ml,加上以上各种成分。充分研磨混合后，再加入多余的酒精，使用前用蒸馏水稀释2倍。染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。
染液：碱性品红花 0.3克 苯酚 5克
酒精（95%） 10ml 蒸馏水 95ml
溶液Ⅰ和溶液Ⅱ分别配制后混合。
步骤：斜面培养10~12小时的苏云金杆菌 试管 中加入无菌水，半个小时后，用接种环在洁净玻片上点上9环，自然凉干，用媒染剂染5~7分钟，轻轻用水冲洗。苯酚品红染色5分钟后水洗，凉干待检。
注意：鞭毛染色时涂片不能用火焰固定，否则受热后鞭毛蛋白变性，鞭毛收缩，无法看到。
