细胞凋亡蛋白在肝癌发生过程中的作用

摘要
目的: 进一步探讨促凋亡蛋白Bid 在肝癌发生发展过程中的作用.
方法: 应用基因毒性化学剂二乙基亚硝胺(diethylnitrosamineDEN)制备肝癌动物模型通过阻断肝细胞凋亡信号传导途径观察肝癌发生过程中肝细胞的增生指数(BrdU LI)与凋亡比率(AI)及与肿瘤发生的关系.
结果: (1)在DEN用药后的第3 d 和第10 d 野生型小鼠肝细胞BrdU标记指数和凋亡细胞百分比分别明显高于Bid缺陷小鼠(P <0.05). (2)在DEN 用药后的第4 mo 野生型小
鼠肝内损伤性结节的数量和表面积明显多于Bid 缺陷小鼠二者间具有统计学意义(P <0.001).
结论: Bid 缺陷小鼠对DEN诱导的肝癌具有明显的抵抗作用这一作用可能与早期肝细胞凋亡有关.

0 引言
细胞增生和凋亡之间的失平衡是肿瘤发生最根本的原因.细胞对任何包括化学物理和生物的有害刺激的反应是通过自身修复死亡再增生等方式使机体恢复自身平衡细胞在损伤修复过程中的错义修复导致基因的突变使细胞获得了异常增生能力便发生了肿瘤.实际上肿瘤组织内细胞增生和凋亡比率均较正常状态的组织有明显增加而增生比率高于凋亡. Bid 是Bcl-2 家族成员中一个促凋亡蛋白通过死亡受体激活细胞凋亡尤其是肝细胞的凋亡过程.我们应用化学致癌模型和Bid缺陷小鼠研究细胞凋亡在肝癌发生的早期作用设想是早期凋亡刺激细胞增生发生基因变异的细胞较正常细胞具有明显的增生优势通过比较野生型和Bid 缺陷鼠对DEN 诱导致癌损伤的反应和观察细胞增生和凋亡的比率进一步探讨肝癌发生的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/B6 小鼠野生型和Bid 缺陷型各14 只 (由美国匹斯堡大学病理系荫博士提供) 分别分为DEN 组和对照组. DEN 组小鼠出生后第14 d 腹腔内注射DEN 15 mg/g 对照组注射同体积的生理盐水饲养3 10 d 和4 及8 mo 分别杀鼠在杀鼠前2 h 腹腔注射30 mg/kg BrdU (Sigma 美国) 收集肝组织标本分别放置液氮中或制备石蜡切片.
1.2 方法
1.2.1 肝细胞凋亡和增生的检测 采用TUNEL 试剂 盒(Roche 美国)检测肝细胞的凋亡操作按照说明. 细胞增生的检测应用抗BrdU 单克隆抗体(Dako 公司美国)进行免疫组化染色.
1.2.2 特殊酶学染色 葡萄糖-6- 磷酸酶 (G-6-Pase)染色:冰冻肝组织切片戊二醛固定后用2 g/L硝酸银和0.53 g/LG-6-Pase 共同孵育45 min 然后用75 g/L 硫酸铵孵育2 min 水洗后用戊二醛和冰醋酸按一定比例混合固定HE 染色封片. GST-pi 染色: 采用兔抗鼠GST-pi 多克隆 抗体 (StressGen 美国)进行免疫组化染色.
1.2.3 肝细胞损伤结节或肝肿瘤 HE 染色的肝组织切片在显微镜下观察和计数肝损伤或肝肿瘤结节的数量应用SPOT软件计量结节的面积求结节面积与全肝面积的比值.统计学处理 细胞增生及凋亡指数和肝损伤结节的数量及平均面积采用Student t 检验P 值小于0.05 为有显著差异.