细胞及亚细胞组分的分离

 细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成，细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等，这些也称为亚细胞组分。对于细胞的结构及功能的研究，是细胞生物学的基本课题，其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分 。这种拆离的方法，使细胞中各种生物学过程彼此分开，互不干扰，便于确定一种复杂过程中的细节，从而深化我们对细胞整体功能的认识。用这种方法已经阐明了细胞中的许多重要反应，例如蛋白质的合成机制，最初发现细胞质粗提液使RNA翻译出蛋白质，将细胞质提取液分部分离，依次得到核糖体、tRNA和各种酶，用分别加入或不加入这些纯组分的方法，证实所有这些分子构成了蛋白质合成体系，以后用同样的体系阐明了遗传密码。
    分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。差速离心适于分离密度和大小显著数量级差别的颗粒，用在分离细胞器是成功的，也是最常用的。对于精细部分的分离，则密度梯度离心效果更好，但制备介质梯度比较费时。
    然而，针对不同的材料和分离目的不同，采用的分离介质及方法也有所不同。
    操作方法：
（一）  制备大鼠肝细胞匀浆
　实验前大鼠空腹12h，取肝脏，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取组织2g，
剪碎，用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液（分数次添加），在0～4℃ 冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
（二）  差速离心
 先将9ml 0.34mol/L蔗糖溶液放入离心管，再沿管壁小心地加入9ml大鼠肝匀浆覆盖在
上层。
1． 分离细胞核（图）
2． 收集质膜
吸出细胞核沉淀中较疏松的上层，混悬于比重d ₂₀ ＝1.16的蔗糖溶液中，沿管壁小心地
加入 离心管 ，使其覆盖在等量的比重d ₂₀ ＝1.18的蔗糖溶液上。700g×10min离心，质膜最终集中在二层溶液的界面上。用尖头吸管小心地吸出质膜。
3． 细胞核纯化
将细胞核沉淀悬浮于5倍体积的0.34mol/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(AC) ₂ 溶液中，铺在4倍
于核悬液体积的0.88mol/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(AC) ₂ 溶液之上，1,500g×20min离心，弃上清，沉淀为纯化的细胞核。在RSB溶液中置4℃可保存数天。在0.01mmol/L EDTA -0.5mmol/L二硫苏糖醇（ DTT ）-5mmol/L MgCl ₂ -50mmol/L Tris -HCl 缓冲液 （pH7.4）中，－20℃可保存数月。