亚细胞器及亚细胞结构的分离实验

一、亚蛋白质组的提取和初步分离

1. 线粒体的富集

材料和设备
(1) 蔗糖溶液: 浓度 1 5 % 、2 0 % 、2 5 % 、27. 5 % 、30% 和 3 5 % (m/V)。

(2) 蛋白酶抑制剂混合物。

(3) 磷酸盐缓冲液 (PBS):1. 4 m m 〇 l/L KH2PO4 ，8 m m o l / L Na2 HPO4，140 m m o l / L NaCl，2.7 m m o l / L KCl，pH 7. 3。

⑷ 200 mmol/Ln-十二烷基-片1>麦芽糖苷 [10%(m/V) 月桂酰麦芽糖苷]。

(5) 水平式超速离心机及转子 (swing-out ultracentrifuge and rotor)。

(6) 异质同晶聚合物离心管。

如上所述将细胞进行裂解及勻浆。优先采用机械破碎方法 (Goldberg,2008)，避免加入去污剂，因其可能导致线粒体和其他细胞区室的渗漏。

一 般 方 案

⑴ 使 用 PBS 清洗细胞 2 次 。

(2) 使用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的 PBSC l m L /10⁹ 个细胞) 重悬细胞。以Potter-Elvehjem 型或杜恩斯 (Dounce) 匀浆器 (通过活性染色检验) 破 碎 细 胞 ，次数多于2 〇次。

(3) 可以选择性采用 5 个或更多的冻融循环，5 次 或 更 多 的 超 声（ 每 超 声 5 s，暂停5 s)，弗式细胞压碎器、高压勻浆 (5 〇 0〜1000 bar，循 环 2 次) 或玻珠研磨机等方法，依照相应的厂家所提供的方案对细胞进行处理。为了进行下一步的处理，于 4°C 以 500 g 离心
5 m i n 将裂解液进行预澄清处理。

步骤

(1) 向最高蛋白质浓度为 5 m g /m L 的线粒体膜的 P B S 悬浮液中加入月桂醇麦芽糖苷 ，使其终浓度为 1 % 。

(2) 混勻后置于冰浴孵育 30 m i n 。

(3) 以 70 000 g 离心 30 m i n 。

(4) 收集上清液, 弃去沉淀。

(5) 向样品中加人蛋白酶抑制剂混合物，并将其放置于冰浴直至离心操作开始。

(6) 如蔗糖梯度制备完成，则可以观察到不连续的蔗糖层分布。将样品小心地加入离心管中梯度的顶层, 操作时应保持离心管的稳定。

(7) 将异质同晶聚合物离心管置于较大的水桶型转子中，设置为最低的加速度和减速度，以 4°C 、130 000 g 离心 16 h 。

(8)小 心 地 从 上 往 下 取 出 500 的组分进行分析。其余的组分放置于一 80℃ 冻存。

其他密度梯度的制备

对于大量的蛋白质，也可制备相应地多重的梯度或者也可以将之前的梯度按比例放大。例如,40 m g 的线粒体可以通过总体积为 40 m L 的蔗糖梯度溶液来进行分离。

⑴ 如 下 所 述 采 用 蔗 糖 溶 液 :55%(5 m L )、50%(5 m L )、35%(10 m L )、30%(10 m L )和 25%(2 m L )。

(2) 向梯度溶液的顶层加入 8 t n L 的线粒体上清液 (溶 解 于 1 % 的月桂酰麦芽糖苷，以 72 000 g 离心 30 m i n )。

(3) 将加速度和减速度设置为最低，以 4°C 、115 000 g 离 心 17 h 。

除了经典的蔗糖密度梯度的介质以外，也可以采用其他供应商提供的不同介质分离亚细胞结构和细胞器。其中最为突出的介质为蔗聚糖 (Ficoll) ( K u r o k a w a etal.， 1965)，Percoll (Pertoft et al.， 1977) 、Nyc o d e n z (R ick w ood et al.， 1982) 和Optiprep (van Veldh o v e n e t a l .， 1996)。相关的更为详尽的方案可参考相应的供应商所提供的操作手册。

2.内膜的富集 (L O P I T )

材料与设备

(1) 勻 浆 缓 冲 液 :250 mmol/L 蔗 糖 。10 mmol/L HEPES^NaOH(pH 7.4),1 mmol/LEDTACpH 8. 0) ,I mmol/L DTT

(2) Optiprcp 储 存 液 :6 0 % 的 碘 克 沙 醇 水 溶 液 。

(3) 系 统 缓 冲 液 ：60 mmol/L HEPES——NaOH (p H 7. 4 ) ， 6 mmol/L EDTA (p H8.0) ,6 mmol/L DTT

⑷ 碘 克 沙 醇 缓 冲 溶 液 : 将 I 体 积 的 系 统 缓 冲 液 加 入 到 5 体 积 的 Optiprep 储 备 液 中配 制 而 成 。

注 意 : 所 有 的 溶 液 需 现 用 现 配 , 且 使 用 前 一 直 放 置 于 4°C 保 存 。

步骤

(1) 在 4°C 、2200 g 离 心 5 min，对勻浆液进行预澄清处理，以去除完整的细胞、细胞核和细胞壁碎片。

(2) 将上清液轻轻倒入到一个干净的离心管中，按上一步骤条件再次离心。

(3) 将所得的上清液分成 6 等 份 , 移 入 6 个离心管中, 然后在离心管底部加入 6 mL1 8 % 碘克沙醇缓冲溶液。

(4) 采用超速离心机，在 4°C 、100 OOOg 离 心 2 h。

(5) 从中间相收集细胞生物膜的粗提物 (一 般 为 6〜8 mL)。

(6) 采用碘克沙醇缓冲溶液稀释细胞膜提取物，并使用碘克沙醇缓冲溶液原液将碘克沙醇的浓度调整为 1 6 % 。

(7) 将经过调整的溶液倒入到 2 个聚碳酸酯离心管中，使用超速离心机，将减速度设为最低，在 4°C 、350 OOOg 离 心 3 h。

(8) 从聚碳酸酯离心管中每个梯度的顶部收集 2 0 个 〇.5 mL 的密度组分。

(9) 向每个所选择的 0. 5 mL 的密度组分中加入 800 pL 的 162. 5 mmol/L 的 Na2C a使其终浓度为 100 mmol/L。

(10) 于冰浴中孵育 30 min, 使用超速离心机，在 4°C、100 000 g 离 心 25 min, 弃去上清液。

(11) 使 用 I mL 的去离子水于 4°C 清洗沉淀, 如上步骤离心 10 min, 弃去上清液。

3.不同去污剂的分级分离

试剂与设备

(1) 100 m m o l / L E D T A : 称 取 3. 36 g E D T A 溶 解 于 1 〇〇 mL 的水中。室温储存。

(2) 100 m m ol/L 苯甲磺酰基氟化物（PMSF): 称 取 174 m g 的 PM SF 溶 解 于 1 〇 mL的异丙醇中。

(3) 哌嗓-N，N ‘-双 (2-乙磺酸）（PIPES) 储存缓冲液 (10x ): 以 0.4 5um 无菌过滤器过滤后，于 4°C 避光储存。

⑷细胞溶质蛋白抽提缓冲液 (0.015% 洋地黄皂苷，pH 6.8,4℃）: 取一个有小搅拌棒的烧瓶，先加 入 4 mL IO X 的储存缓冲液，然 后将 18.75 m g 的洋地黄皂甙 (calbi 〇 chem)通过加热溶解于其中，再加 入 I m L 的 PMSF。与余下的 6 mL IO X 的储备缓冲液和 5 mL
E D T A 合并。加水定容至 100 m L。

(5) 细胞膜蛋白质抽提缓冲液 (0.5 % Triton X-100,p H 7. 4,4℃）合 并 10 mL I O X的储备缓冲液、〇. I m L P M S F 、3 m L E D T A 和 5 m L 新鲜制 备 的 10% Triton X-100, 加水定容 至 100 m L 。

(6) 细胞核蛋白质抽提缓冲液 ( 1 % T w e e n -40/0.5% 11-脱氧皮质固酮 (D O C ) ，p H7.4,4°C ): 分别将 0•5 g D O C 和 I m L T w e e n -40 各溶解于 2. 5 m L I O X 的储备缓冲液中(如必要时可加热助溶），合并后加入 5 m L 10 X 的储备缓冲液和 I m L P M S F , 加水定容至 100 m L

(7) 细 胞 骨 架 溶 解 缓 冲 液 (5%SDS，10mmol/L磷酸钠，pH7.4): 对于非还原型缓冲液，溶 解 〇• 5 g 的 S D S 于 5 m L 20 m m o l / L p H 7. 4 的磷酸钠缓冲液中。加水定容至10 m L 。对于变性缓冲液，再 加 入 I m L 的片巯基乙醇。最后加水进行适当调整。

步骤

(1) 采用冰浴冷却的细胞溶质蛋白抽提缓冲液冲洗细胞 (5 体积/g 湿重 ，轻微涡旋振荡重悬细胞) 或单层细胞 (I m L /T 2 5 细颈瓶）。

(2) 冰上孵育并温和振荡 (平台式混合器) 细胞，直至通过台盼蓝染色实验表明 9 5 % 〜1 0 0 % 的细胞已是可渗透的 (5〜10 m i n )。

(3) 对于悬浮培养的细胞，以 500 g 离心所提取的混合物, 并除去上清液。

⑷对于单层细胞, 倾斜培养瓶并用吸管吸出提取物 (富含细胞溶质蛋白质的组分），再储存于一 70°C 。

(5) 使用与用于细胞质蛋白提取液同体积的冰浴冷却的细胞膜蛋白质提取缓冲液(相对于初始材料湿重 5 倍的体积) 小心地重悬未溶解的颗粒，以获得均一的悬浮液。

(6) 对于单层细胞，向每个 T25 细颈瓶 (细胞含量约 5 X IO⁶个 ) 中 均 加 人 I m L 的细胞膜蛋白质提取缓冲液。

(7) 冰上孵育并温和振荡 30 m i n 。

(8) 以 5000 g 离心悬浮液 10 m i n 移出提取物 (富含细胞膜和细胞器蛋白质的组分)或倾出单层细胞。

(9) 等量分装，储存于一 70°C 。

(10) 以用于细胞膜蛋白质提取时一半的细胞核蛋白质提取缓冲液重悬悬浮培养的不溶性颗粒。

(11) 4°C 、6000 g 离 心 10 m i n ，使残余的不溶于去污剂的组分形成沉淀，移除提取物(富含细胞核蛋白质的提取物）。

(12) 对于每个与 T 2 5 细颈瓶相当量的单层细胞, 采用〇.5〜 I m L 的细胞核蛋白质提取缓冲液提取。

(13) 等量分装, 储存于一 70°C 。

(14) 对不溶于去污剂的颗粒，采用冰浴冷却的 P B S ( p H 7. 4, I.2 m m o l / L P M S F ) 冲洗 ，然后通过重悬 (聚四氟乙烯树脂/玻璃匀浆器)，并设 定 4°C 、12 000 g 离 心 20 m i n 的方法机械破碎 D N A 或加 入 1000 单位的 Benzonase 核酸酶 (E M D /Novagen) 将核酸进行酶解。

(15) 采用一 20°C 的 9 0 % 丙酮清洗悬浮培养的沉淀 1 次 ，冻干 ，再置于已经去了皮重的离心管中称重。所得的样品储存于一 70°C 。

(16) 对于单层细胞，采 用 P B S 进行原位 (in W i w ) 清 洗 ，其中残余的去垢剂不溶组分（细胞骨架）可直接加入 0.5-1 ml 不含β-巯基乙醇非变性的细胞骨架溶解缓冲液进行重悬。储存于-70℃。

3.膜质筏的富集 (去垢剂不溶组分分离）

材料与设备

(1) TNE 缓冲液 [25 mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5 ) 、 50 m mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA] 含 1 % (译者 注 ： 似原文有误，疑 为 含 l% T rito n X -100)。

(2) 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 (calbiochem)。

(3) Nycodenz。

(4) 外开式的离心机和相应的转子。

(5) 异质同晶聚合物离心管。

步骤

⑴ 在细胞培养瓶中铺上2. OXIO⁷〜3. OXIO⁷ 的培养细胞 (贴壁的或悬浮的）。

(2) 预温处理的 P B S 清洗细胞 2 次 。

(3) 在无血清的培养基中，于 37°C 下采用β- MCD(lO m m ol/L) 处理细胞 45 m in 和/或胆固醇处理 I h 。

(4) 需要时，在进行处理之后或 72 h 时感染刺激细胞。

(5) 采 用 含 有 1 % T r i t o n X -I O O 的预冷 T N E 缓 冲 液 7 5 0 斗 裂 解 细 胞 ，再加人蛋白酶和磷酸酶抑制剂，于冰浴中孵育 30 m i n 。

(6) 采 用 7 0 % 的 N y c o d e n z 1500 juL 与裂解物混合, 再溶解于 T N E 缓冲液中。

(7) 取上述混合液加人到容积为 4 m L 的异质同晶聚合物超速离心管的底部。

(8) 再向离心管底部加人 T N E 缓冲 液 ，配 制 2 5 % 、21. 5 % 、1 8 % 、1 5 % 和 8 % 的 N y -codenz，混匀。

(9) 采用外开式转子，设 定 4°C 、200 000 g•离心 4 h。

(10) 从每个离心管的顶端到底部取 3 5 0 斗 的 组 分 进 行 W e s t e r n B l o t 分析。

(11) 分 析 W e s t e r n Bl o t 结果，以验证小窝蛋白 1 呈阳 性 (3〜6 部分) 或有抗洗涤剂的细胞膜组分的存在。

4.细胞核和组蛋白的富集

清洗后的细胞核颗粒的制备

核小体和游离组蛋白的分离需要以清洁的细胞核为初始原料。本方案中，采用匀浆和非离子化去污剂 N P -40 处理培养的细胞获得细胞核。采用含有去污剂的缓冲液清洗细胞数次，以除去细胞膜，从而得到含有相对清洁的细胞核颗粒。之 后 ，采 用 N a C l 提取以去除大多数与染色质轻微结合的蛋白质。然而, 相对于其他提取细胞核的方法，以 N P -40 进行清洗可导致提取物活性丢失。如需要将细胞核和染色质同时都提取出来，那么应
采用如下所述的方法提取细胞核, 而所得的细胞核颗粒可用于制备染色质（Schnitzler，2001)。

材 料 与 设 备

(1) 2 m o l / L N a C l

⑵ 细 胞 核 沉 淀 缓 冲 液 2 (N P B ):0.6 m 〇 l/L K C l ，1 0 % (V /V ) 甘油。

(3) D 0u n c e 勻浆器及 B 型研棒。

⑷ 细 胞 核 沉 淀 缓 冲 液 (N P B )。
20 m m o l / L H E P E S , p H 7. 5；3 m m o l / L M g C l 2; 〇.2 r n m o l / L E G T A

(5) 于 4°C 下可储存数周。临用前加入:3 m m o l / L 2-巯基乙醇、0. 5 m m o l / L P M S F 、I um o l / L 胃酶抑素 A(pepstatin A )、1 p m o l / L 亮抑蛋白酶肽 (Ieupeptin)。

(6) 亮抑蛋白酶肽。

配 制 I m m o l /L 的水溶液作为储存液，于一 20° C 下可储存 1 年 。

(7) 溶菌缓冲液 (lysis buffer, L B )。

20 m m o l / L H E P E S ， p H 7. 5; 0•25m o l / L 廉 糖 ；3 m m o l / L M g C l 2;0.5 % (V /V )Nonidet P -40 (N P -40)。

(8) 于 4°C 下 可 储 存 数 周 。临 用 前 加 人 :3 m m o l / L 2-巯 基 乙 醇 、0.5 m m o l / L P M S F 、I umol/L 胃酶抑素 A 、1 fxmol/L 亮抑蛋白酶肽。

注 意 ： 除了另有说明，所有的溶液均放置于冰浴或 4°C 。

步骤

(1) 3 X I O⁹个细胞 (H e L a ) 用 I L P B S 清洗两次。

(2) 采 用 40 m L 的 L y sis 缓冲液重悬颗粒沉淀。

(3) 以 B 型研棒的 D o u n c e 匀浆器设定约 1 5 次冲击裂解细胞。通过光学显微镜监测细胞的裂解效果。

(4) 4°C 、3000 茗离心 15 m i n 。

(5) Lysis 缓冲液重悬颗粒沉淀 2 次 ，再 以 N P B 重 悬 1 次 。

(6) 采 用 2 倍沉淀体积的 N P B 重悬细胞核，并测量悬浮液的总体积。

(7) 温和搅拌的同时，滴 加 1 个总体积的 N P B 2。

(8) 于 4°C 下 ，持续温和搅拌 10 m i n 。

(9) 4°C 、17 5 0 0 容离心 30 m i n ，获得细胞核颗粒沉淀。

(10) 采用液氮或干冰冷冻细胞核颗粒，于一 80°C 可 储 存 1 年以上。

5.核 心 组蛋白的纯化

材料与设备

(1) 细胞核颗粒沉淀 (如上所述)。

(2) 含有及不含有 2. 5 mol/L N a C l 的羟基磷灰石 ( H P ) 缓冲液 (如下所述)。

(3) BioGel H T P 粉末 (Bio-Rad)，吸附容量为每克干粉吸附 0. 6 m g 的 D N A 。

⑷ 2 c m X 15 c m 的层析柱及配件。

(5) Centriprep-IO 浓 缩 器（Amicon; optional)。

(6) 其他检测蛋白质浓度及 S D & P A G E 所用的试剂和设备。

(7) H P 缓冲液:50 m m o l /L 磷酸钠 ( p H 6. 8),0. 6 m o l / L N a C L 于 4°C 下可储存数周 。临用前加入:1 m m o l / L 2-巯基乙醇，0. 5 m m o l / L P M S F 。

步骤

(1) 采 用 25 m L 的 H P 缓冲液重悬含有约 6 m g D N A 的 约 2 m L 细胞核颗粒。

(2) 于 4°C 下 ，温 和 搅 拌 10 m i n 。为 了 避 免 蛋 白 质 水 解 ，可 向 H P 缓冲液中加人I u mol/L 胃酶抑素和 I um o l/L 亮抑蛋白酶肽。

(3) 加 人 10 g BioGel H T P 干粉 (羟磷灰石)。

⑷ 加 人 H P 缓冲液制备 I : 1 的浆液。将其倒入到 2 c m X 15 c m 的层析柱中，并收集洗脱液。

(5) 采 用 300 m L H P 缓冲液(30 m L / h ) 清洗树脂。于步骤 (3)[译者注: 似原书有误，疑为步骤 (4)] 及第一个柱体积清洗所得的洗脱液含有 H l 。

(6) 采用含有 2. 5 m o l / L N a C l 的 H P 缓冲液洗脱核心组蛋白，收 集 8 m L 的组分。

(7) S D S ——P A G E 分析核心组蛋白的纯度。

(8) 如有必要采用 Centriprep-l O 浓缩器将核心组蛋白的浓度浓缩至 10 m g /m L 。

(9) 分为若干等份进行分装，干冰冻结，于一 80°C 可 储 存 4 年 。

6.细 胞 核 提 取 物 的 富 集

材料与设备

(1) 细 胞 核 缓 冲 液 I (N B l ) : 25 m m o l / L H E P E S ( p H 7. 9)、 5 m m o l / L K C 1、0.5 m m o l / L M g C l 2、I m m o l / L D T T 、100 m m o l / L P M S F ，定容至 100 m L

(2) 细胞核缓冲液 2 (N B 2):100 m L N B 1 + 1 m L N P -40 [ 1 % 聚乙二醇苯基醚 (I G E -P A L )]。

(3) 细胞核缓冲液 3 (N B 3) :1：1 混 合 N B l 与 N B 2。

⑷ 细 胞 核 缓 冲 液 4 (N B 4) :25 m m 〇l/L H E P E S ( p H 7. 9) ,350 m m o l / L N a Cl

(5) 亮抑蛋白酶肽、PMSF 、抑肽酶、胃酶抑素和 D T (Calbiochem)。

(6) IGEPAL CA-630 (Sigma)。

注意: 在操作过程中，所有的组分 (缓冲液、蛋白酶抑制剂等) 必须置于冰浴中。

步骤

下述方案适于对 IO⁷ 个细胞进行操作。

(1) 去除培养基并加人 I m L 冰浴冷却的 P B S 。

(2) 将细胞刮人 P B S 中, 再将其转移到 eppend 〇 rf 离心管中，以 10 000 g 离 心 5 m i n 。

(3) 去除上清液，用 200 的 N B l 重悬沉淀颗粒 (可按比例进行放大或缩小）。

(4) 加 入 2 0 0 斗 的 N B 2, 于 4°C 旋 转 15 m i n 。

(5) 2500 g离心 I m i n 。

(6) 将上清液转移到一个新的 eppendorf 离心管中 (富含细胞质蛋白质组分)。

(7) 再次加 入 100 ) u L 的 N B 3, 轻轻混合。将洗液转移到步骤
(6) 中制备的细胞质蛋白溶液中。如颗粒沉淀被扰动，可能需要进行短时间的离心处理。

(8) 加 入 500 p L 的 N B 4, 于 4°C 旋 转 I h 。

(9) 在最大速率下旋转 10 m i n ，所得的上清液即为细胞核蛋白质样本。

7.用于细胞器富集的免疫亲和试剂

材料与设备

(1) protein A/protein G 偶联于固定相，缓冲液为含有 1 % B S A 、100 m m o l / L N a C l和 0. 0 1 % N a N 3 ，p H 7. 0 的 H E P E S 。

(2) 单克隆抗体或多克隆抗体。

(3) 洗涤缓冲液工（w a s h buffer 工， W B 1) :20 m m o l / L H E P E S , p H 7. B S A 。

(4) 洗漆缓冲液 I K w a s h buffer II， “ W B 2):20 m m o l / L H E P E S , p H 7.0;100 m m o l / L N a C l 。

(5) 洗 脱 缓 冲 液 （elution buffer， E B ):0.1% S D S ， 50 m m o l / L Tris， p H 6. 5;100 _ ol/L D T T 和 1 0 % 甘油。

步骤

如上所述进行细胞裂解液的预澄清。

(1) 4 ° C ，温和搅拌，过夜孵育裂解液、抗体 (依据供应商提供的信息）、protein A /prot e i n G 和固定相 (30 M L 1 : 1 的浆液）。

(2) 4°C 、500 g■离心 5 min。

(3) 采 用 500 的洗涤缓冲液 I 洗涤颗粒沉淀，重 复 3 次 。

⑷ 采 用 500 的洗涤缓冲液 II 洗涤颗粒沉淀, 重复 2 次 。

(5) 采 用 30uL 洗脱缓冲液洗脱包被的小囊泡/细胞器, 如果需要则在温和的提取条件下进行。

(6) 以 5000 g•离心 I m i n 。所得的上清液即为富含网格蛋白包被的小囊泡的溶液(图 19.6)。