有丝分裂实验

一、实验目的

学习植物根尖压片方法的基本技术。熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。

 

二、实验原理

 

有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。

 

三、实验材料

 

洋葱（Aillum cepa）根尖

 

蚕豆（Vicia faba）根尖

 

四、实验器具和药品 试剂

 

显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培养皿、纱布、吸水纸、铅笔、吸管。

 

卡诺氏固定液（甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份）、改良苯酚品红染色液（见附录：实验 试剂 的配制）、 0.002M 8-羟基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1N HCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大树胶。

 

五、实验方法和步骤

 

（一）材料准备 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20～25℃培养箱内培养。当根尖长1～3cm 时，即可以进行预处理。

 

（二）预处理 为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。处理的方法如下：

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1．秋水仙素水溶液 常用浓度为0.05～0.2%，室温下处理2～4小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。

 

2．对二氯苯饱和水溶液 室温下处理3～5小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。

 

3．8-羟基喹啉水溶液 使用浓度为0.002— 0.004M ，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理2～4小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。

 

4．低温处理 将材料如小麦，浸入 蒸馏 水内，放置到1～ 4℃ 冰箱中（玉米及水稻6～ 8℃ ）处理20～24小时，也起到良好的效果。

 

下表为不同材料采用不同预处理方法获得的效果，供参考。

植物名称	染色体数(2n）	处 理 因 素	处理时间	温 度	效 果~K~Htd~M~1~0~0~0~0~0~K~Htr~M~1~0~0~0~0~0~Ktr~M~1~0~0~0~0~0~0~Ktd~M小麦	42	0.2%秋水仙素水溶液	9:00-11:00	25℃	+++
小麦	42	对二氯苯饱和水溶液	10:00-14:00	室温	+++
小麦	42	1～ 4℃ 冰箱	20-24小时	1～ 4℃	+++
小黑麦	56	对二氯苯饱和水溶液	10:00-14:00	室温	+++
豌豆	14	对二氯苯饱和水溶液	10:00-11:30	室温	+++
烟草	48	对二氯苯饱和水溶液	8:30-11:30	室温	+++
蚕豆	12	0.05～0.1%秋水仙素水溶液	20:00-23:00	室温	+++
蚕豆	12	0.05～0.1%秋水仙素水溶液	14:30-17:30	8℃	+++
洋葱	16	0.05～0.1%秋水仙素水溶液	7:30-11:30	15℃	+++
茄子	24	0.002M 8-羟基喹啉	9:00-13:00	15℃	+++
大麦	14	0.05～0.1%秋水仙素水溶液	8:00-11:00	25℃	++

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（三）固定 通常采用的是卡诺氏固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理3～24小时。材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内0～4℃保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。

 

（四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到青霉素小瓶子内，用清水洗几次，吸干水，加入1N HCl溶液，在 60℃ 下水解8～20分钟（洋葱用8分钟，蚕豆侧根用10分钟，玉米用20分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。解离后的根尖用水轻洗2～3次，以利于着色。

 

（五）染色、压片 将解离后的根尖放在凹面玻片内（根尖较长的切除伸长区部位），滴加改良苯酚品红染色液染色10分钟左右。制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取 1mm 左右的生长区，其余部分弃掉，加半滴染色液，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用解剖针或铅笔上的橡皮头敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，以盖玻片不破裂为准。

 

（六）观察 将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变化。

 

（七）永久装片 由临时压片材料做成永久玻片标本，一般以正丁醇法最为简单可靠。步骤如下，取四个大培养皿，分别装入下列溶液：

 

1．	3/4 95%酒精+1/4冰醋酸	5～10分钟
2.	2/3 95%酒精+1/3正丁醇	3分钟
3.	1/3 95%酒精+2/3正丁醇	3分钟
4.	纯正丁醇	3分钟
最后用加拿大树胶封片