有丝分裂重组和随机孢子分析实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

酵母菌株
YPD 平板无菌接种环

步骤

第 1 天把菌株和 4-2 接到 YPD 平板上，在 30°C下培养。第 3 天上午，把菌株4-1和 4-2进行杂交。把一个菌株4-1单菌落和一个菌株4-2单菌落转移到一个无菌的离心管中。加人 20(^1水，振荡，离心 30s。去除大部分的液体并将细胞转移到一块Y PD 平板上。 30°C 下培养 4h。在 Y PD 平板上将杂交细胞进行划线。用四分体解剖显微镜和显微操作仪鉴定哑铃形合子并将它们移到YPD 平板上一个开放的区域。在 30°C下培养。此外，将混合菌在SD+ lys平板上划线以筛选二倍体，在 30°C下培养。第 5 天将合子菌点板到Y P D 和 SD+ ly s平板上，确定结果的正确性。以母菌株作对照

$从 S D + ly s平板仔细挑取二倍体并点在S D + ly s和 YPD平板上。第 6 天检查 S D + ly s平板鉴定4-1X 4-2二倍体。 L O H 晚上，用菌株4-1X 4-2二倍体接种5ml YPD，用菌株 4 -2 单倍体接种5ml YPD作对照，在 30°C下振荡培养。减数分裂重组为制备菌株 4 -1 X 4 -2 二倍体的孢子形成物，挑取二倍体接种在 YPD平板上，在 30°C下培养过夜。第 7 天突变和 L O H 将菌株4-1X 4-2 二倍体混合培养液在无菌试管中制成1 0 倍系列稀释度。用 1〇〇4 的 10— \ 10— 2和 10— 3稀释液分别涂在SC +5-FO A 和 S O a rg + 刀豆氨酸平板测定LO H 频率。同时，用 10(^1的 1CT4和 1(T5稀释液涂Y PD 平板，测定活细胞数量。为了测定C A N ]和 U RA 3的基因的自发突变率，需把菌株4 -2 单倍体细胞制成类似的稀释度。然后用lOOjul的 1CT1和 10— 2稀释液涂在SC +5-FO A 和 SC -arg+刀豆氨酸平板。同样，也应取l 〇〇fxl的 1CT4和 1CT5稀释液涂YPD 平板以测定活细胞数，所有的平板置于30°C培养。减数分裂重组按照 “技术和方案1 0 , 随机孢子分析” ，将 YPD 平板的菌株4-1X 4-2 二倍体转接到液体产孢子培养基中，置 25°C培养。第 1 0 天突变和 L O H 据选择性平板和YPD 平板的菌落数，计算菌株4-1X 4-2二倍体和菌株4-2单倍体CanR 和 5-FOAR 的频率。用多头接种装置（ frogger)，对每种药物抗性菌株点接 2 2 个独立的菌落在 SC + 5 - FOA、 SC-arg + 刀豆氨酸、 SC-met (为评估 HOM5 ) 和 YPD 平板上。如果没有足够菌株4-2的菌落，可以涂仅有的，包括菌株4-1X 4-2 二倍体、亲本单倍体菌株4-1和 4-2作为对照。减数分裂重组检查 4-1X 4-2培养物的孢子形成情况。如果培养物已经形成孢子，照 “技术和方案1 0 , 随机孢子分析” ，进行酶解破开四分体，用随机孢子的稀释液涂平板。第 1 1 天突变和 L O H 根据片状或点状菌株的生长，计算 5-FO A平板上初筛CanR 菌株的频率和在刀豆氨酸平板上初筛5-FOAR 菌株的频率。第 1 3 天使用多头接种装置，涂或点45个来自菌株4-1X 4-2 二倍体的独立的随机孢子菌落到三块YPD 平板上以及下列平板上： SC-ura、 SC-his、 SC-met和 SC-arg+ 刀豆氨酸平板各一块。包括菌株4-1X 4-2二倍体和亲本单倍体菌株4-1和 4-2作为对照。在 YPD 平板上开始杂交测试菌株4 -3和 4-4 。$
第 1 4 天检测随机孢子克隆的杂交型。从 YPD平板上用多头接种装置将0. 2m l的含有菌苔 4-3的 YPD培养物涂开到SD平板上。同样在SD平板上处理菌苔4-4。第 1 5 天分析杂交型平板要扣除交配不良的菌株，因为它们或许不是单倍体分离子。此外，在 YPD 平板上显示为红U d d ) 和白（ ADE2 ) 细胞混合的分离菌是可疑的。第 1 6 天减数分裂重组根据点种的孢子菌落生长情况，测定 C A M 、 URA3 、和 HOM3 基因之间的减数分裂重组频率。

第 1 4 天检测随机孢子克隆的杂交型。从 YPD平板上用多头接种装置将0. 2m l的含有菌苔 4-3的 YPD培养物涂开到SD平板上。同样在SD平板上处理菌苔4-4。第 1 5 天分析杂交型平板要扣除交配不良的菌株，因为它们或许不是单倍体分离子。此外，在 YPD 平板上显示为红U d d ) 和白（ ADE2 ) 细胞混合的分离菌是可疑的。第 1 6 天减数分裂重组根据点种的孢子菌落生长情况，测定 C A M 、 URA3 、和 HOM3 基因之间的减数分裂重组频率。

来源：丁香实验