免疫血清的鉴定、纯化和保存

一、免疫球蛋白的提取与鉴定：
各类免疫球蛋白及其与其它血清蛋白间，根据它们的分子大小、电离密度、等电点以及在水溶液中的溶解度不同等，得以相互鉴别与分类。利用上述特性，还可以从液体中分离和提取各种免疫球蛋白。
（一）免疫球蛋白的分离提取：
1．盐析法（Salt fractionation）：蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同。血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。其方法步骤如下：
（1）配制饱和硫酸铵溶液：取500ml蒸馏水加热至70~80℃，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20分钟，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底，其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调pH为7.0。
（2）用50%饱和硫酸铵提取血清中β、γ球蛋白：血清一份加生理盐水一份混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵二份中，边加边搅拌，防止形成团块降低沉淀物的特异性。混匀后静置30分钟或置4℃冰箱过夜。
（3）高速低温离心10000rpm，10分钟，将上清液（含白蛋白）弃去，取沉淀物（含球蛋白）溶于少量生理盐水中。
（4）用33%饱和硫酸铵提取γ球蛋白，方法是将上述提取物生理盐水溶液两份加一份饱和硫酸铵。然后再离心10000rpm，其余操作同上。
（5）按同样方法用33%饱和硫酸铵再提取一次。
（6）将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。
经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。
2．凝胶过滤法（Gel filtration）：
利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶做为介质，可分离提纯分子量不同的大分子物质。在凝胶过滤过程中，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先流出凝胶柱外，分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢而最后流出柱外，这样就能将分子量不同的物质分离。
（1）材料：
样品（正常人血清），Sephadex G-200，2.5×100mm层析柱，洗脱液（PBS或含NaCl的Tris―HCl缓冲液）。
（2）方法：
①处理凝胶：将Sephadex G―200用蒸馏水经充分膨胀后进行浮选。
②装柱：在层析柱底部铺加一层尼龙纱，然后将洗脱液饱和凝胶粒子沿插入柱底的玻璃棒缓缓倾注于层析柱内。
③加样：在凝胶柱表面再加一层尼龙纱，沿管壁缓缓加入样品，所加样品的体积不超过凝胶柱的10%。
④洗脱：洗脱液洗脱，流速20ml/小时。待样品洗脱下来（用20%磺酸水杨素检测）既用试管分段收集。
⑤蛋白测定：在紫外分光光度计上测定各管样品的O.D280nm，以判读各管蛋白含量。
附：样品洗脱完毕后，凝胶即已再生。一次装柱可反复使用多次。凝胶悬液加防腐剂后于冰箱内可保存数月。
（3）结果分析：正常人血清经凝胶过滤后可分出三个主要蛋白峰。IgM是在第一峰中，和IgM分子量接近的α2―巨球蛋白也在第一峰。第二峰主要是IgG，在第二峰开始部分含IgA和IgD，第三峰为蛋白和分子量100，000以下的球蛋白。
3．离子交换层析法（Ion exchange chromatography）：
以离子交换剂为介质，吸附带相反电荷的高分子物质，由于高分子物质的电荷量，等电点不同，用不同离子强度或pH值的洗脱液能置换不同的高分子物质。据此可分离提纯免疫球蛋白，是目前最广泛应用的高分子物质提纯方法之一。
（1） 材料：样品（经pH8.0，0.015M PB透析过的正常人血清，或经饱和硫酸铵提取的免疫球蛋白），DEAE―纤维素（阴离子交换剂），2.5×25cm层析柱，及洗脱剂（不同离子强度的PB）。
（2） 方法：
①离子交换剂的预处理：取适量DEAE―纤维粉剂，用0.5N NaOH除去色素和细粒，用蒸馏水洗成中性后，再用0.5N的HCl洗涤，最后用蒸馏水洗成中性并用缓冲液平衡。
②装柱：与凝胶过滤相同。
③加样：在层析柱顶部留有少量缓冲液时，既开始加样。在样品渗入柱内液面约留有0.5ml时，以数毫升缓冲液冲洗柱壁。然后滴加洗脱剂并调整流速为1~2ml/分，进行洗脱。
④洗脱：根据提取免疫球蛋白种类的不同而选择不同pH及克分子量（molar solution “M”）。例如提取血清IgG用0.01 M pH7.4洗脱，而血清IgA则为1M pH6.4为洗脱液。
⑤蛋白测定：同凝胶过滤法。