原理
具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物（即多克隆抗体）。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。
材料与仪器
家兔
灭菌生理盐水 IgG 酒精 碘酒 羊毛脂 石蜡油 BCG FIA FCA-IgG
剪刀 镊子 注射器 针头 称量瓶 量筒 动物固定架 三角烧瓶 手术器械 血管夹 黑丝线 放血管
灭菌生理盐水 IgG 酒精 碘酒 羊毛脂 石蜡油 BCG FIA FCA-IgG
剪刀 镊子 注射器 针头 称量瓶 量筒 动物固定架 三角烧瓶 手术器械 血管夹 黑丝线 放血管
步骤
一、免疫方法
根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤。
2. 第一次免疫
用2 ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）下称FCA IgG液1 ml，每侧脚掌皮下各注入0.5 ml。
3. 第二次免疫
间隔10-14 天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1 ml，其余注入淋巴结附近皮下共1 ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。
4. 间隔7-10 天后，从耳静脉采血0.5～1.0 ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免疫。即于1 周内注射3 次，分别为0.1、0.3、0.5 ml。间隔1 周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也可在第2 次免疫后，以弗氏不完全佐剂（FIA）乳化的抗原（人IgG）（简称FIA-IgG）再免疫1-2 次。注射部位、剂量和间隔均同第2 次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
二、放血
1. 心脏采用血法
（1）家兔仰面，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。
（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮肤。
（3）用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位。
（4）用50 ml注射器（连接16号针头），倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死。
（5）将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。
2. 颈动脉放血法
（1）家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤。
（2）沿颈部中线切开皮肤约10 cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌。
（3）分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。
（4）于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。
（5）用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。
（6）松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100 ml。
根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤。
2. 第一次免疫
用2 ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）下称FCA IgG液1 ml，每侧脚掌皮下各注入0.5 ml。
3. 第二次免疫
间隔10-14 天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1 ml，其余注入淋巴结附近皮下共1 ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。
4. 间隔7-10 天后，从耳静脉采血0.5～1.0 ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免疫。即于1 周内注射3 次，分别为0.1、0.3、0.5 ml。间隔1 周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也可在第2 次免疫后，以弗氏不完全佐剂（FIA）乳化的抗原（人IgG）（简称FIA-IgG）再免疫1-2 次。注射部位、剂量和间隔均同第2 次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
二、放血
1. 心脏采用血法
（1）家兔仰面，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。
（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮肤。
（3）用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位。
（4）用50 ml注射器（连接16号针头），倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死。
（5）将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。
2. 颈动脉放血法
（1）家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤。
（2）沿颈部中线切开皮肤约10 cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌。
（3）分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。
（4）于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。
（5）用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。
（6）松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100 ml。
三、分离血清
将三角烧瓶的血置37 ℃温箱1 小时，再置4 ℃冰箱内3～4 小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000 rpm离心15 分钟，取上清加入防腐剂（0.01 ％硫柳汞或0.02 ％叠氮钠，最终浓度），分装后置4 ℃冰箱中保存备用。
注意事项
1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。
2. 免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡（频率2900 转/分，振幅6 mm）；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1 小时即可使抗原充分乳化。
3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物（0.005 mgN）产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5 mg/kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10 倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。
5. 免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6 点皮下注射，同时于两侧肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一处。每点注0.2 ml，间隔2 周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。
常见问题
一、结果鉴定
以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。
来源：丁香实验
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