免疫血清的制备实验

制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。

（一）抗原制备和动物的选择
1．抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。
2．动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。

（二）抗原的注射途径和剂量
1．注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。近期发展在局部淋巴结或足 等部位注射抗原。不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。
2．抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。
3．每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为2~4天。加佐剂抗原为10~15天。

（三）佐剂的作用原理及种类：
1．原理：佐剂又称免疫增强剂。它可以增强抗原的免疫原性及改变机体的免疫反应性，达到增强免疫力或提高抗体产生水平及在体内维持时间明显延长。
2．种类：通常多用福氏佐剂（Freund adjuvant） ，它分为福氏不完全佐剂（Incomplete Freund adjuvant）和福氏完全佐剂（Complete Freund adjuvant）。福氏不完全佐剂既抗原水溶液（1~5mg/ml）1ml、油剂（液体石蜡）4ml、乳化剂（羊毛脂）1g混合而成油和水的乳悬液。福氏完全佐剂在上述成份中按10mg/ml加入卡介苗。
3．配制方法：先将羊毛脂与液体石蜡混合分装小瓶，高压蒸汽灭菌，8磅20分钟，保存4℃冰箱，使用前再溶化，制备可分研磨法和注射法。前者将乳悬液在微火上溶化后，按比例加入卡介苗，边滴边研磨，使菌体完全分散，按同法加抗原，每加1滴应研磨数转直至小滴消失，加抗原要慢，待抗原全部滴入后则成乳白色粘稠的油包水乳剂。后者将等量的乳悬液和抗原卡介苗混合液分别吸入两个附有针头的5毫升注射器内。将其之一与约长6厘米的塑料管连接，针头穿入约1厘米，然后稍稍推动针管，使液体进入塑料管直至距塑料管开口端还有1厘米距离为止，同时由另一人将另一个5毫升注射器与塑料管开口端相连，此时二人相对而坐，左手固定针头与注射器的连接处，右手交替推动针管，反复操作，直至形成粘稠的乳剂为止。
制成的乳剂是否油包水乳剂，直接影响到免疫的效果，因此每次制成后要进行检查。方法是将佐剂抗原滴入冷水表面，滴入后应保持完整而不分散，若滴入后分散，说明不合格，要另行配制。

（四）免疫的方法：
1．无佐剂免疫法：应根据抗原的性质采用合理方法。颗粒性抗原（红细胞、细菌）通常不需采用加佐剂方法。将某种抗原（浓度约1%）根据下列的顺序、每次间隔3~5天免疫动物（兔）
皮下注入抗原 0.3ml
肌肉 0.4ml
足 0.4ml
静脉（耳） 0.4ml
皮内 0.5ml
于最后一次注射后7天，采耳血，分离血清，用特异抗原测定其效价。
2．福氏佐剂免疫法：
1）一般免疫方法：第一针剂量为每只家兔注射1毫升加佐剂的抗原。注射途径为两只后足掌，每只0.2毫升，其他各淋巴结附近部位，多点皮内注射。总量为0.6毫升。第二针间隔在第一针免疫后3~4周。剂量为不加佐剂的抗原1毫升。注射途径为背部多点皮下注射。
第三针间隔时间为第二针免疫后1~2周，剂量和途径同第二针。
2）淋巴结免疫法，卡介苗致敏：每只兔后足各注射活卡介苗（75mg/ml）0.3ml，10~14天后两侧 窝淋巴结可肿大，如蚕豆大小，既可作淋巴结注射。
第一针于两侧 窝淋巴结内注射佐剂抗原（1mg/ml），每个淋巴结内注射0.25ml。注射加强针，两次间隔时间、注射次数、剂量、途径与一般免疫方法相同。

（五）采血
1．试血：一般在最后一次注射后的7~10天，既可由耳缘静脉取少量血，分离血清进行试血。多采用环状试验，在10分钟内能出现“++”沉淀环为合格。目前更多采用双向扩散法，经37℃24小时后观察结果，效价在1:16以上既可用。
2．放血：当免疫血清效价达到所需要滴度时，由心脏或颈动脉用无菌手续采血。
（六）分离血清：
将收集血置无菌 试管 或三角瓶内，凝固后，用无菌滴管沿 试管 边缘将血块与瓶壁脱离，先放37℃，2小时后，再放4℃过夜，使 血清 充分析出，经离心2000rpm，20分钟，分离出 血清 ，待鉴定合格后方可使用。