T淋巴细胞转化试验（T Lymphocyte Transformation Test）
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一、 基本原理
T细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴细胞转化试验结果的读取可以有形态计数法、MTT法和同位素法三种。
MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定 细胞培养 物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
3 H-TdR 掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说，一个细胞周期可大致分为四期，即G 1 期、S期、G 2 期和M期。其中S期为DNA合成期，主要功能活动为DNA合成。 3 H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[ 3 H-methyl]thymidine），是DNA合成的前体。加入 细胞培养 液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的 3 H-TdR就越多，因此，检测所掺入的 3 H-TdR就可反映细胞增殖的程度。该方法与MTT比较，具有灵敏度高、准确性好的特点，但由于该方法有同位素污染问题，因此，从安全角度考虑，我们实习中仍用MTT法。
二、 实验材料
1. ICR小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）
2. RPMI1640培养液, Hank’s液
3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI1640液配成1mg/ml，分装小瓶，冷冻保存
4. MTT (1mg/ml, 溶于Ph7.2的PBS中)
5. 2.5%碘酒、75%酒精
6. 无菌尖吸管和刻度吸量管
7. 无菌解剖器械
8. 96孔平底培养板
9. 5%CO 2 培养箱（美国NAPCO公司产品）
10. 酶标测定仪 （美国BioRad公司产品）
三、 实验方法
1.小鼠脾细胞悬液的制备：
取一个灭菌的平皿，加入5ml Hank’s液。颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。取出100ml用于计数。将其余细胞悬液移入一 离心管 中，离心1500rpm，7min，（或1000rpm，10min）弃去上清，用RPMI1640培养液稀释，制成2.5×10 6 / ml的脾细胞悬液，然后加入ConA使每孔最终浓度为2mg/ml，同时做不加ConA的阴性对照孔。
2.将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中，每孔0.1ml。
3.将培养板放入含有5%CO 2 的37℃培养箱中培养48-72小时，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入1mg/ml MTT液，10ml/孔。37℃培养6小时。
4.各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇110ml，30分钟内（或加2% SDS 100ul/孔，过夜）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。
四、 实验结果
将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
五、注意事项
（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
T细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴细胞转化试验结果的读取可以有形态计数法、MTT法和同位素法三种。
MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定 细胞培养 物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
3 H-TdR 掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说，一个细胞周期可大致分为四期，即G 1 期、S期、G 2 期和M期。其中S期为DNA合成期，主要功能活动为DNA合成。 3 H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[ 3 H-methyl]thymidine），是DNA合成的前体。加入 细胞培养 液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的 3 H-TdR就越多，因此，检测所掺入的 3 H-TdR就可反映细胞增殖的程度。该方法与MTT比较，具有灵敏度高、准确性好的特点，但由于该方法有同位素污染问题，因此，从安全角度考虑，我们实习中仍用MTT法。
二、 实验材料
1. ICR小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）
2. RPMI1640培养液, Hank’s液
3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI1640液配成1mg/ml，分装小瓶，冷冻保存
4. MTT (1mg/ml, 溶于Ph7.2的PBS中)
5. 2.5%碘酒、75%酒精
6. 无菌尖吸管和刻度吸量管
7. 无菌解剖器械
8. 96孔平底培养板
9. 5%CO 2 培养箱（美国NAPCO公司产品）
10. 酶标测定仪 （美国BioRad公司产品）
三、 实验方法
1.小鼠脾细胞悬液的制备：
取一个灭菌的平皿，加入5ml Hank’s液。颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。取出100ml用于计数。将其余细胞悬液移入一 离心管 中，离心1500rpm，7min，（或1000rpm，10min）弃去上清，用RPMI1640培养液稀释，制成2.5×10 6 / ml的脾细胞悬液，然后加入ConA使每孔最终浓度为2mg/ml，同时做不加ConA的阴性对照孔。
2.将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中，每孔0.1ml。
3.将培养板放入含有5%CO 2 的37℃培养箱中培养48-72小时，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入1mg/ml MTT液，10ml/孔。37℃培养6小时。
4.各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇110ml，30分钟内（或加2% SDS 100ul/孔，过夜）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。
四、 实验结果
将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
五、注意事项
（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
