淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT）

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T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素 Phytohemagglutimin，PHA）或特异性抗原 刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加并能进行分裂，成为淋巴母细胞，即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之
一、形态学检测法
【原理】
淋巴细胞在有丝分裂原（PHA或ConA）或特异性抗原刺激下发生转化，产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率，了解机体的细胞免疫 状态。
【材料】
Wright-Giemsa染液
细胞培养 液：多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20%无菌NBS、PHA 50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）。
肝素（400单位/ml，用Hanks液配制），0.5 ml可抗凝血5 ml。
2.5%碘酒、75%酒精。
载玻片、无菌棉签、无菌注射器5 ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。
【方法】
1． 灭菌器材 将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌，0.103 Mpa（15磅/吋2）20 min。
2． 分装培养液于各培养瓶中，每瓶2 ml。
3． 抽取静脉血0.2 ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5%CO2孵箱培养72 h，期间每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。
4． 培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000 r/min离心10 min。
5． 由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后，残留与管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列（计数走向似城墙形）进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。
【结果】
1． 用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。
⑴ 成熟的小淋巴细胞：与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。
⑵ 过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
⑶ 淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
⑷ 其它细胞：如中性粒细胞在培养72 h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。
2．计算

转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过度型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60～80%，如为50～60%则偏低，50%以下则为降低。
问题：
1．T，B淋巴细胞在何种情况下能发生转化现象？何谓转化现象？
2．做淋巴细胞转化实验过程中要注意什么问题

二、3H-TdR掺入法
【原理】
T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷，加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量（以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低，测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。
【材料】
纯系小鼠20～25 g
闪烁液
RPMI1640培养液
刀豆蛋白A（ConcanvalinA，ConA）：用1640液配成1 mg/ml分装小瓶，冷冻保存，用时稀释成所需浓度。
9999型玻璃纤维滤液
消毒微量培养板
3H-胸腺嘧啶核苷，原液为1 mci/ml，放射性比强度为25 ci/mM，用无菌生理盐水稀释成10 ci/ml，用时每孔加入20 μl。
细胞收获仪
液体闪烁计数器
5%CO2温箱
【方法】
1． 制备脾细胞悬液，用1640培养液稀释，使成2.5×106ml，然后加入ConA10μl，使每孔最终浓度为2μg/ml，同时做不加ConA的阴性对照孔。
2． 将上述细胞悬液加入微量细胞培养板中，每孔0.2 ml。
3． 将培养板放入5%CO2的37℃温箱中培养72 h，在培养结束前6 h，于培养板各孔内加入3H-TdR 20μl，使每孔最终浓度为1μci/ml。
4． 用细胞收获仪收集在玻璃纤维滤纸上，蒸馏水充分洗涤，温箱烘干。
5． 将纸片放入液体闪烁仪内，用液体闪烁计数器测量放射性。
【结果】
结果表示方法用液体闪烁器每分钟记录的脉冲数（cpm）表示。
转化值=加ConA孔的细胞掺入3H-TdR的cpm平均值减不加ConA对照孔的细胞掺入值，亦可用刺激指数表示实验结果。