ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性实验
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小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体,在有IL-1同时存在的条件下,IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(3H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位,或计算出刺激指数。
(二) 操作步骤
取6~8周龄C57BL16小鼠,拉颈处死,无菌取胸腺
置不锈钢网筛上,用注射器针蕊研磨成细胞悬液
调整细胞数为1.5×107/ml
↓
细胞悬液内加入ConA,使终浓度为3μg/ml,在96孔
培养板中加100μl(1.5×106细胞)
↓
加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品
100μl/孔(ConA终浓度为1.5μg/ml)
↓ 37℃ CO2孵箱 66h
每孔加3H-TdR 0.5μci
↓37℃ CO孵箱 6h
多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上
↓
烤干,移入液闪瓶中,加适量闪烁液,于液闪仪上测β计数
计算:
1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位
2. 也可用刺激指数(SI)表示
实验组cpm
SI=────── ×100%
对照组cpm
(三)
试剂
和器材
1. 10% FCS RPMI1640,96孔培养板,CO孵箱
2. 标准IL-1, ConA
3. 3H-TdR,PPO、POPOP,二甲苯
4. 9999型玻璃纤维
滤纸
,细胞收集仪
5. β液闪计数仪
(四) 注意事项
1. 不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异,据国内资料报道以C57BL为好。
2. 不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一,一般选用6~8周龄,小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。
3. ConA促丝裂原作用要进行预试,一般采用亚适剂量。