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总糖和还原糖的测定:3,5-二硝基水杨酸法

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目的要求

掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。

实验原理

在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。

一、 试剂

3,5-二硝基水杨酸(DNS) 试剂 :称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000mL容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000mL。

葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100mL,即含葡萄糖为2.0mg/mL。

6mol/L HCl:取250mL浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500mL。

碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

6mol/L NaOH:称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

二、材料

藕粉,淀粉。

三、器材

试管 1.5×15cm(×13), 3.0×20cm(×1);移液管0.2mL(×2),0.5mL(×2),1mL(×5), 10mL(×1);水浴锅;电炉;分光光度计。

操作方法

一、 葡萄糖标准曲线制作

取6支1. 5 cmm×1.5cm 试管 ,按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号

葡萄糖标准液(mL)

蒸馏水(mL)

葡萄糖含量(mg/mL)

A540

0

0

1

0

 

1

0.2

0.8

0.4

 

2

0.4

0.6

0.8

 

3

0.6

0.4

1.2

 

4

0.8

0.2

1.6

 

5

1

0

2

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL,于沸 水浴 中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0mL,摇匀,在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。

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