总糖和还原糖的测定:3,5-二硝基水杨酸法
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目的要求
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。
实验原理
在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
一、 试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS) 试剂 :称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000mL容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000mL。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100mL,即含葡萄糖为2.0mg/mL。
6mol/L HCl:取250mL浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500mL。
碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。
6mol/L NaOH:称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
二、材料
藕粉,淀粉。
三、器材
试管 1.5×15cm(×13), 3.0×20cm(×1);移液管0.2mL(×2),0.5mL(×2),1mL(×5), 10mL(×1);水浴锅;电炉;分光光度计。
操作方法
一、 葡萄糖标准曲线制作
取6支1. 5 cmm×1.5cm
试管
,按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。
管号 |
葡萄糖标准液(mL) |
蒸馏水(mL) |
葡萄糖含量(mg/mL) |
A540 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
1 |
0.2 |
0.8 |
0.4 |
|
2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
|
3 |
0.6 |
0.4 |
1.2 |
|
4 |
0.8 |
0.2 |
1.6 |
|
5 |
1 |
0 |
2 |
在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL,于沸 水浴 中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0mL,摇匀,在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。