还原糖和总糖的测定3,5

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一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物 样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子 水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1． 实验材料

小麦面粉；精密pH 试纸。

2． 主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×1

（2）大离心管：50mL×2

（3）烧杯：100mL×1

（4）三角瓶：100mL×1

（5）容量瓶：100mL×3

（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1

（7）恒温水浴锅

（8）沸水浴

（9）离心机

（10）扭力天平

（11）分光光度计

3． 试剂

（1）1mg/mL 葡萄糖标准

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

（3）碘-碘化钾溶液：称取5g 碘和10g 碘化钾，溶于100mL 蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：称取0.1g 酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。

（5）6M HCl 和6M NaOH 各100mL。

四、操作步骤

1． 制作葡萄糖标准曲线

取7 支20mL 具塞刻度试管编号，按表1 分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0 号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。