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还原糖和总糖的测定3,5

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一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计
的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物 样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子 水,所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 实验材料
小麦面粉;精密pH 试纸。
2. 主要仪器
(1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11
(2)大离心管:50mL×2
(3)烧杯:100mL×1
(4)三角瓶:100mL×1
(5)容量瓶:100mL×3
(6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1
(7)恒温水浴锅
(8)沸水浴
(9)离心机
(10)扭力天平
(11)分光光度计
3. 试剂
(1)1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液,加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5g 碘和10g 碘化钾,溶于100mL 蒸馏水中。
(4)酚酞指示剂:称取0.1g 酚酞,溶于250mL 70%乙醇中。
(5)6M HCl 和6M NaOH 各100mL。
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取7 支20mL 具塞刻度试管编号,按表1 分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作

将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,冷却至室温,用蒸馏水定容至20mL,加塞后颠倒混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0 号管调零点,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。

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