siRNA的设计与制备

一．siRNA的设计
在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物细胞，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

选择siRNA靶位点：
从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为侯选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’端和3’端的非编码区（untranslated regons, UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

序列同源分析：
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能始位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。

设计阴性对照：
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

此外网上提供提供免费的siRNA设计工具www.qiagen.com/siRNA,
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/

二．siRNA的获得

1．化学合成
尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的---研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。它最适用的情况是：已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-for Silencing siRNA duplexes” : 针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。

Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6×10 ⁴ cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit eith primers targeted to lamin.