采用RNaseⅢ制备siRNA分子实验

首先在体外以长为 200~1000 bp 的 cDNA 为模板转录合成正义与反义的单链 RNA 分子，然后通过退火形成长的 dsRNA 分子，再用Diccr 核酸酶进行切割得到 siRNA 分子的混合物，通过纯化去除没有被切割的双链 RNA 分子和 DNA 模板以后，siRNA 分子就可以用于转染细胞。由于在混合液中含有大量的以目的基因不同位点为靶的 siRNA 分子，因此可以获得对靶基因的高效抑制效果。

DNA 寡核苷酸 靶基因 cDNA Dicer 酶 蛋白酶 K
DNase Ⅰ 单链特异性的 RNase 反应缓冲液 EDTA 水饱和酚 氯仿 异戊醇
T7 RNA 体外转录试剂盒 聚丙烯酰胺凝胶 电泳装置

一、材料与设备

1. 合成的 DNA 寡核苷酸。

2. 靶基因 cDNA。

3. T7 RNA 体外转录试剂盒（Promega 公司）。

4. DNase Ⅰ 和单链特异性的 RNase。

5. 重组的 Dicer 酶。

6. 蛋白酶 K ( 0.2 mg/ml）。

7. 1X Dicer 反应缓冲液（250 mmol/L NaCl，30 mmol/L HEPES ( pH 8.0 )， 0.05 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L MgCl₂ )。

8. EDTA 10 mmol/L ( pH 8.0 )。

9. 水饱和酚。

10. 氯仿：异戊醇 ( 24 : 1 )。

11. 聚丙烯酰胺凝胶。

12. 电泳装置。

二、操作方法

1. 将靶基因 cDNA 片段按正反两个方向克隆到 T7 启动子的下游，并采用 T7 RNA 体外转录试剂盒转录合成互补的两条 RNA 链，两条 RNA 链在体外互补形成双链 RNA 分子，纯化后备用（具体的操作方法见体外转录合成 siRNA 分子）。

2. 在 1X Dicer 反应缓冲液中加入约 500 ng 纯化后的双链 RNA 和适量的 r-Dicer，在 37℃ 反应适当的时间后（通过预实验确定）加入 10 mmol/L EDTA 终止反应，经蛋白酶 K 处理后，采用酚：氯仿：异戊醇 ( 25 : 24 : 1 ) 抽提。如果是大量制备的话，其中的蛋白质与残留的长 dsRNA 应该通过凝胶纯化或通过柱层析纯化。

3. 纯化获得的 siRNA 分子混合物可以直接用于转染细胞，或置 -20°C 保存。siRNA 双链复合物可以经过几轮冻融而不受影响，不需要经过再次变性退火处理。但是在处理 siRNA 分子时，建议最好将 RNA 溶液置于冰浴中，以降低 RNA 水解的速率。

4. 为了确定获得的 siRNA 分子的大小，可以通过 18% 变性聚丙烯酰胺凝胶 ( PAGE ) 进行分离并用合成的单链 RNA 分子作为对照；也可以通过 15% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，分子量对照采用合成的双链 siRNA 分子。