用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA库

其他制备siRNA的方法都需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个最有效的siRNA。而用RNaseIII降解长片断双链RNA成为siRNAs库就象制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”， RNase III的完全降解产物（12—15bp）同样可以诱导专一的基因沉默，效果与化学合成或者是酶法得到的siRNAs相当。该方法是选择200—1000bp的靶mRNA，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNaseIII(或Dicer)酶在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。除掉没有被消化的dsRNA，siRNA混合物就可以直接转染细胞。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

主要优点：

1. 可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，避免化学合成siRNA的昂贵费用，siRNA表达载体的繁琐劳动，以及为找到一个有效的siRNA 序列所必经的漫长的筛选过程，为研究人员节省时间和金钱（通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜），是一种比较简单粗放、快速、性价比很高的方法。

2. 可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况一般不会造成影响。最近一篇关于RNase III制备的siRNAs和相关的RNA结合蛋白的文章同样证实没有非特异基因沉默的发生。在除了哺乳动物细胞以外的其他系统中，可以通过Dicer酶复合物消化长片断RNA双链，得到针对同一个靶基因多个位点的siRNAs群，从而特异的抑制目的基因的表达。这些结果提示存在某种适当的机制来维护抑制反应的高度专一性。Ambion公司曾经用它的SilencersiRNA Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成功关闭几个基因，包括c-fos, GAPDH, La, ß-actin, 和Ku-70。

3. RNase III能够消化各种来源的双链RNA。

4. RNase III 得到的12-15bpsiRNAs库能够非常有效的抑制基因的表达。在这个siRNAs库中既有一些有效的siRNAs分子，也有很多无效的siRNAs部分。

5. 导入这种方法制备的siRNA库，并没有表现比用化学合成法制备特定的siRNAs更高的毒性或者是对基因表达的非特异效应。

因而，采用RNase III 制备siRNAs混合库可以成为有别于传统方法的制备siRNA的另一种好办法。

适用：1.快速经济地研究某个基因功能缺失的表型

2.只需要运用RNAi 技术作为遗传工具，快速得到RNA干扰结果，而无需详细研究siRNA具体信息的研究人员
不适用：1.长时间的研究项目

2.需要一个特定的siRNA，特别是基因治疗