RNA 干扰(RNAi)实验技术相关探讨

摘要：RNA 干扰(RNAi)是一种由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi 技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。
关键词：RNAi；siRNA；转染
小RNA 作用与应用研究继2001，2002 连续两年被美国Science 杂志评为年度10 大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA 干扰（RNAi），即用20 多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi 沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA 的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA 对细胞行为的调控、如何利用RNAi 进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。

1、 RNAi 的作用机制

通过生化和遗传学研究表明，RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA 被切割为21-23 核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer 的酶，是RNase III 家族中特异识别双链RNA 的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA 降解为19-21bp 的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2 个碱基突出。在RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC 需要一个ATP 依赖的将小分子RNA 解双链的过程。激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上，并在距离siRNA3’端12 个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC 都包含一个siRNA 和一个不同于Dicer 的RNA 酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA 在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段，这种dsRNA 可使内源相应的DNA 序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）：

图1、RNAi 的作用机制

2、RNAi 基本试验程序及注意事项
2.1、 siRNA 的设计
2.1.1、目标序列的筛选
在设计RNAi 实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.1.2、RNAi 目标序列的选取原则
RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3"端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC 含量在45%—55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5"和3"端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
2.1.3、阴性对照
一个完整的siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA 应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA 序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
2.1.4、目前已证实的siRNA 可以在下面的网页找到：
人源：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/20/4DWPG_0911115002
鼠源：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/22/4DWPG_0911115002
其他：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/23/4DWPG_0911115002
2.2、 siRNA 的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs 经RNase III 类降解 (e.g. Dicer， E. coli， RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA 表达载体或者病毒载体，PCR 制备的siRNA 表达框在细胞中表达产生siRNA。