简介
RNAi 是一种通过体内的剪切形成小的（大约 21 nt）双链 RNA，而其中的反义链与靶向基因的转录本互补，形成的双链结构介导持续的靶向基因的降解，从而使得靶向基因沉默。与基因敲除相比，RNAi 介导的基因沉默更加快速，节约高效，其广泛地被用于功能基因组的研究，也非常适应研究广泛生物的同源基因。
原理
基于 RNAi 的 knock-down 的技术原理是使用 Ⅱ 型启动子转录长的反向互补长片段，经过转录形成长的发卡结构转录本，经过细胞内的 RNA 加工形成双链的短的干扰 RNA；同样可以通过单个 Ⅱ 型启动子启动反向互补的目标 siRNA 序列形成一个发卡结构，最终经过剪切形成双链 siRNA；使用两个 Ⅱ 型启动子启动短的 RNA 退火形成双链短 RNA；以及表达 miRNA 在体内形成可 knock-down 的短单链 RNA。这些载体都最终形成 RISC，随后形成组织 mRNA 的剪切或降解，从而使得目标基因沉默。
材料与仪器
器材：
一次性无菌手套、手术钳、注射器、移液枪、枪头、PCR 仪、水浴锅、离心机、电泳仪；
材料：
小鼠、促性腺激素、DNA 聚合酶、限制性内切酶、连接酶、琼脂糖、电泳缓冲液。
步骤
一、RNA 干扰靶点的筛选
（一）查找 mRNA 序列或序列的登录号
（二）利用网上免费工具进行 RNAi 的靶序列设计
二、RNA 干扰载体的构建
（一）pSico 寡聚核苷酸的设计
根据第一部分提供的方法我们可以找到合适的 CD8 的靶向序列，以 19mer：GCTACAACTACTACATGAC 为例。那么正向引物可以设计为：5'-TGCTACAACTACTACATGACT-TCAAGAGAGTCATGTAGTAGTTGTAGCTTTTTTG 反向引物为：5'-GTTACAAAAAAGCTACAACTACTACAT-GACTCTCTTGAAGTCATGTAGTAGTTGTAGCA 这样就可以保证退火时 5' 为末端，3' 为 XhoI 酶切后的黏末端。
（二）克隆寡聚核苷酸到 pSico 载体
1．订购引物：订购引物时需要 5' 磷酸化，PAGE 纯化。用水稀释到 100 μmol/L。
2．退火
3．连接转化：按照酶切体系进行连接，室温孵育 3 小时后加入 2 μl 连接酶，随后进行细菌转化。
4．阳性克隆的酶切鉴定 使用 Sac II-Not I（pSico）或 Xho I-Xba I（pSicoR）双酶切进行阳性克隆鉴定。其中酶切出来的小片段阳性比空载大 50 bp（pSico 中空载为 660 而阳性的为 710；pSicoR 中空载为 350 阳性载体为 400 bp）。
5．测序验证 构建好的载体最好要进行测序以确认载体是否符合设计。测序时应注意此载体会形成发卡结构，请使用特殊的测序。
三、knock-down 干扰模型的建立
使用制作 shRNA 质粒载体，线性化后直接原核注射小鼠受精卵，操作方法与普通转基因小鼠的制备方法类似。
四、干扰效应的检测及表型分析
（一）检测小鼠体内的 mRNA 水平：在 mRNA 水平可以使用 Northern blot，qRT-PCR，原位杂交，大规模的甚至可以使用芯片技术检测目标基因的表达水平。
（二）使用 Western blot，IF，ELISA，FACS 等检验干扰的效果。
注意事项
RNAi 的作用是高度序列依赖的，虽然这些机制还没有完全弄清楚，但目前有一些原则可使得我们设计的 RNAi 高效。如下：
1、靶向基因的 cDNA 靶向区域必须位于起始密码子（ATG）下游 50～100 nt。
2、寻找 AA（N19）TT 或 r NA（N21），或 NAR（N17）YNN 的序列基序。其中 N 代表任何核苷酸，R 代表嘌呤（A，G），Y 代表嘧啶（C，U）。
3、避免靶向到内含子中，因为 RNAi 仅在细胞质中而不在细胞核工作。
4、避免序列的 G ＋ C 含量大于 50％。
5、避免连续 4 个或更多的核苷酸重复。
6、即使 RNAi 靶向到非编码区能够成功诱导基因沉默，也要避免基因的非翻译区。除非你需要抑制内源靶基因的表达后再表达突变体或标签融合基因，使之与内源基因相区别而设计到非翻译区位点等。
来源：丁香实验
