RNA沉默在分析植物基因功能方面的研究

牛颜冰﹡，郭失迷，申林炎，雷万钧，雷霄飞
（山西农业大学，太谷 030801）
摘　要：RNA 沉默是真核 生物 的一种高度保守的和序列特异的RNA 降解系统，它不但是基础 生物 学领域的研究热点，同时在调节基因表达或研究基因功能方面也是非常有前景的。植物中的转录后基因沉默(PTGS)是RNA 沉默的一种形式，通过PTGS 能对目标RNA 进行特异性降解。对双链RNA(dsRNA)在RNA 沉默启动中所起中心作用的认知，形成了几种RNA 沉默载体的构建方法，这些方法与基因组资源相结合，通过转基因或非转基因的方法能够快速和高效研究植物的基因功能。
关键词：RNA 沉默；分析；基因功能

The research on the analysis of gene function in plants mediated by RNA silencing
NIU Yan-Binundefined, GUO Shi-Mi, SHEN Lin-Yan, LEI Wan-Jun, LEI Xiao-Fei
(Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)
Abstract: Being a highly conserved and sequence-specific RNA degradation system in eukaryotic, RNA silencing is both a fundamental biological issue and a highly promising application upon the control of gene expression or the analysis of gene function. Posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants is a form of RNA silencing by which target RNA is degraded in a sequence-specific manner. Realizing regarding the central role that double-stranded RNA plays in triggering RNA silencing has prompted the development of several vectors construction for RNA silencing. These methods, in combination with the genomic resources, by means of transgenic and non-transgenic technology, have provided rapid and efficient means by which to investigate gene function in a wide range of plant species.
Key words: RNA silencing ; analysis; gene function

RNA沉默是真核生物的一种高度保守的和序列特异的RNA降解系统，该系统包括植物中的转录后基因沉默(PTGS)、动物中的RNA 干扰(RNAi)和真菌中的消除作用(quelling)[1]。对RNA 沉默的遗传和生化研究发现，不同生物体中存在着几个相同的 RNA 沉默相关基因，如RNA 依赖的RNA 聚合酶 (RdRP)、RNA酶Ⅲ样的核酸酶(Dicer)和PAZ/Piwi区的蛋白(ARGONAUTE)，这暗示着真核生物的RNA 沉默是高度保守的。现在公认的RNA沉默机制是双链RNA(dsRNA)高效启动RNA 沉默后，被Dicer 切割成21~26 nt 的小干扰型RNA(siRNAs)，随后 siRNAs 整合入RNA 诱导的沉默复合物(RISC)，并引导RISC 对与siRNAs 同源的目标RNA 进行降解[2]。鉴于RNA沉默可以以序列特异性的行为抑制基因表达，而植物中以基因为目标的同源重组又相当困难，所以RNA沉默是一种极有前途的研究基因功能的反向遗传学研究工具。

RNA沉默作为反向遗传学研究工具，在分析功能基因上，相对于传统正向遗传学有许多优势，如传统的插入突变导致一个家族的某一成员失活后，家族中的其他成员可弥补其功能，从而造成无法研究其家族成员的功能；传统的基因筛选对一些胚发育期必需的基因的插入突变将导致致死型突变，从而得不到突变表型，而 RNA沉默中的病毒诱导的基因沉默(VIGS)是对成株植物诱导产生表型突变，可以对胚发育期致死基因的功能进行研究。RNA沉默通过同源性起作用，如选取所有家族成员的高度保守区，就能沉默整个家族成员。因此，用RNA 沉默分析功能基因就成了分子生物学领域的研究热点。

1.RNA沉默载体的构建方法
Waterhouse等[3]将马铃薯Y病毒(PVY)的辅助因子蛋白(HC-Pro)基因分别正向或反向转入烟草，对其后代杂交分析发现，含有正向或反向HC-Pro 的转基因植株中，仅有15% 的植株对PVY 具有抗性或免疫作用；而同时含有正向和反向HC-Pro 的转基因植株中，对PVY有免疫作用的植株则占转基因植株总数的44%~54%。于是他们推断在同一植物细胞中同时含有正义和反义RNA(即dsRNA)是诱导烟草植株发生RNA沉默或对PVY产生免疫作用的真正原因。几乎与此同时，F i r e 等[ 4 ]将小杆线虫 ( Caenorhabditis elegans )内源 mex-3 的dsRNA 注入 C. elegans，导致C. elegans 内源的mex-3 的转录产物大幅度下降，甚至消失，首次证实dsRNA 的确是RNA 沉默的诱导因子。随着对dsRNA 能高效启动RNA 沉默认识的深入，现发展了几种诱导植物 RNA 沉默的载体构建方法。