成功的RT-PCR的几个要素
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成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。但是我个人认为不会，除非mRNA抽提
试剂
盒或者相关方法对内参以及目的基因的mRNA有选择性，否则样本间抽提效率的差别完全可以用内参来校正啊。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保护 试剂 。Merck的inhibitor是世界第一，大家可以选择性使用。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
2、使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。而且降低逆转录酶的RNaseH活性会加大RT酶的热稳定性。通常有点突变和缺失突变两种，优先选择缺失突变的。此外AMV酶热稳定性更高，推荐。
3、提高逆转录保温温度
较高的温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。
对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物（三种引物都可以的）在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验，是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序？我认为后者才对。
此外是否可以考虑加入RNA inhibitor更为安全一些。
还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用 PCR仪 可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。
然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱，呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶，逆转录反应可以置于较高温度下进行，增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。 此外注意不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外 RNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。
4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。
5、RNaseH处理
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。 通常是不推荐此方法的。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
也可以使用Qiagen等公司的特殊RNA保护 试剂 。Merck的inhibitor是世界第一，大家可以选择性使用。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
2、使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。而且降低逆转录酶的RNaseH活性会加大RT酶的热稳定性。通常有点突变和缺失突变两种，优先选择缺失突变的。此外AMV酶热稳定性更高，推荐。
3、提高逆转录保温温度
较高的温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。
对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物（三种引物都可以的）在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。这个方法可以试一试。但是这个步骤之后反应条件如何设置我没有经验，是加入酶和其他反应组分后变性再RT还是直接开始RT程序？我认为后者才对。
此外是否可以考虑加入RNA inhibitor更为安全一些。
还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用 PCR仪 可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。
然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。上面简单的处理方法倒是不花钱，呵呵。对这些困难模板的扩增可以使用一些特殊的逆转录酶，逆转录反应可以置于较高温度下进行，增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。 此外注意不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。此外 RNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。
4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。
5、RNaseH处理
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡRNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。 通常是不推荐此方法的。
