RAPD方法在细辛类药材鉴别研究中的问题及其对策

黄璐琦 王敏 周长征_李念华*_何希荣 杨滨

（中国中医研究院中药研究所生药室，北京 100700；北京中医药大学中药学院 药用植物教研室，北京 100029；*中国科学院植物研究所，北京 100044）

摘要 以细辛类药材的鉴别为例，对RAPD方法在药材鉴别中所存在的问题探讨，结果表明药材DNA模板浓度，降解程度及药材的产地均对PAPD产物有不同程度的影响，从而提出选择适宜的药材DNA模板浓度，筛选合适的引物采用对照组聚类分析等方法来消除上述因素的影响，进而讨论了PAPD方法在药材鉴别上的适用范围。

关键词 多态性分析； 细辛类药材

90年代在polymerase chain reaction (PCR)技术基础上发展起来的随机扩增的DNA多态性分析(random amplofied polymorphic DNAs, 简称PAPD)已成功地应用于遗传多样性的检测、基因定位和品质鉴定等诸多领域，并已开始用于人参、西洋参、蛇类、地胆草等中药材的鉴定[1]。这一方法快速、简便且灵敏度高，但其应用于遗传多样性和系统学研究中所存在的问题，如DNA模板纯度、浓度及RNA对扩增产物的影响，已引起关注和研究[2]。在药材鉴别方面，还存在如何克服DNA模板降解程度不一对扩增产物的影响，1~2个引物鉴别药材的可靠性，以及RAPD的适用范围、合适引物的筛选等诸多特殊问题。本文以细辛类药材的鉴别为例，针对这些问题，设计了一组实验来进行探讨。

材料和方法

仪器 和 试剂 1169型电脑全自动基因扩增仪（北京市新技术应用研究所）；Micro-MB3616型高速离心机（IEC公司，美国）；UV-Ⅰ型多功能紫外透射仪（北京市新技术应用研究所）。

Tap酶(U-P Biotech, Inc, USA)；琼脂糖(Promega公司)；dNTPs(Promega 公司)； CTAB(Sigma 公司)；溴化乙锭(Fluka 公司)；其余 试剂 为北京化工厂产的分析纯。

材料 细辛类药材和艾叶药材取自中国中医研究院中药研究所标本室；原植物取自中国科学院香山植物园。除艾叶药材由李燕立鉴定外，其余都经杨春澍教授鉴定。材料情况见表1。DNA模板的提取和浓度测定 干药材0.10g或新鲜叶片少许，置1.5ml EP管中，加入液氮用镊子研碎，立即加入500цl保温60℃的2X CTAB提取液[CTAB 2%，Tris-HCI(PH 8.0)100 mmol·L ^-1 ,EDTA 20 mmol·L ^-1 ,NaCI1.4 mmol·L ^-1 ，巯基乙醇2%]及20цl巯基乙醇混匀，60度保温40 min；加入等体积的氯仿一异丙醇（24：1）抽提，轻轻颠倒混匀，10000 r.min ^-1 离心10 min，吸取上清液，加入1/10体积的10% CTAB溶液，再加入等体积氯仿一异两醇（24：1）重复抽提一次，吸取上清液加入等体积的沉淀缓冲液[CTAB 1%，Tris-HCL(pH8.0)50 mmol·L ^-1 ,EDTA 10 mmol·L ^-1 ,巯基乙醇1%]，室温下放置30 min以上，10000 r.min ^-1 离心10 min，小心去上清液，分别用79%乙醇和无水乙醇各洗涤一次，弃掉洗液、挥干。用 分光光度计 测定DNA浓度后时PCR扩增。

Tab 1 The sources ,collectint time and condittion of the crude drugs studieds

No	Name	Source	Collectign time	Conditions
1	Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag	Shanxi	1978.5	dried
2	Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag	Shengang, Liaoning	1982.6	dried
3	Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag	Quanhang,Jilin	1988.4	dried
4	Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag	Changchum, Jilin	1991.10	dried
5	Asarum heterotropoides var. Mandshuricum Kitag	Northeast of China	1994.11	dried
6	Asarum spp	Institute of Acupuncture ,CATCM	1997.7	dried
7	A. heterotropodes var, mandshuricum kitag.	Northeast of China	1997.7	fresh
8	A. sieboldii f. seouleuse C. Y.Cheng et C. S. Yang	Northeast of China	1994.11	dried
9	A. sieboldii f. seouleuse C. Y .Cheng et C. S. Yang	Banxi, Liaoning	1997.7	fresh
10	A. sieboldii Miq	Shennongjia ,Hubei	1996.7	dried
11	A. sieboldii Miq	Luonan, Shanxi	1997.7	fresh
12	A. caulescens Maxim	Chengkou, sichuan	1996.5	dried
13	A. caudigerum Hance	Emei, Sichuan	1997.7	fresh
14	A. splendens (maekawa) C. Y .Cheng et C. S Yang	Emei, Sichuan	1997.7	fresh
15	A. forbesii Maxim.	Jiangpu ,Jiangsu	1988.6	dried
16	A. forbesii Maxim.	Jiangsu	1997.7	fresh
17	A. caudigerellum C. Y . Cheng et C. S. Yang	Emei, Sichuan	1992	dried
18	A. caudigerellum C. Y . Cheng et C. S. Yang	Emei, Sichuan	1997.7	fresh
19	A. dabieshanense D. Q. Wang et. S. H. Huang	Huoshan, Anhui	1996	dried
20	A. dabieshanense D. Q. Wang et. S. H. Huang	Huoshan, Anhui	1997.7	Fresh
21	Artemisia argyi levl. et. Vant.	Shenyang, Liaonign	1991.2	Dried

PCR反应 反应体系总体积50ul，其中引物为1 mmol·L ^-1， 核DNA约150 ng ，Taq酶3U， dNTP _S 各0.05 mmol·L ^-1 。扩增程序为预变性5min，94度40s，38度45s，72度45s40个循环，后延伸72度5 min。取10 ul扩增产物于1.0%琼指糖凝胶上用1X TAE 电泳 缓冲液 电泳，紫外检测拍照。