小规模制备质粒DNA(碱变性-SDS法、SET法)
互联网
1418
一、 目的
学习几种小规模制备质粒DNA的技术，比较这几种方法所制备的几种质粒DNA的效果。
二、 原理
在介绍的载体中，有PUC系列、PBS与PBR322均属拷贝数较高的质粒，只要用小规模制备一次的质粒DNA，就有足够的量用于常规的基因工程操作。小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒DNA(12—24个不同的质粒DNA样品)，速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切、连接，甚至多纯化几次还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。
其中碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分 离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。只是将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ试剂和加入的比例做了修改，这种修改增加了质粒DNA在溶液中的粘度，减少了KAc的离子强度。这种方法对分子量稍大的质粒DNA更合适。
用各种不同孔径的凝胶住层析，进行分离纯化蛋白质、酶、核酸等生物样品的技术。目前也常用DNA的微量过柱以达到纯化DNA的目的。DNA的微量过柱常用Sephadex G50葡聚糖凝胶，做成约300微升凝胶的Eppendorf管小柱，对1～5微克的DNA样品离心过滤20秒钟，就能得到很高的纯化效率。这种过柱的样品可以直接进行DNA测序分析。
三、 材料
(一) 仪器
接种针 1ml移液管
1.5ml Eppendorf管 200ml吸头
冰块 牛皮纸
纱布盖 线绳
(二)器皿
微量移液器
涡流混合器
低温高速离心机
1.5mlEppendorf管
培养皿
(三)菌种
1. 大肠杆菌HB101 (pBR 322)
2. 大肠杆菌JM103 (pUCl8)
3. 大肠杆菌TGI (pBS SK + )
4. 大肠杆菌C600 pXZ6
学习几种小规模制备质粒DNA的技术，比较这几种方法所制备的几种质粒DNA的效果。
二、 原理
在介绍的载体中，有PUC系列、PBS与PBR322均属拷贝数较高的质粒，只要用小规模制备一次的质粒DNA，就有足够的量用于常规的基因工程操作。小规模制备质粒DNA的特点是可以一次制备多种质粒DNA(12—24个不同的质粒DNA样品)，速度快，时间省，步骤简化，DNA纯度好，可以用于酶切、连接，甚至多纯化几次还可做双链DNA序列分析的模板等常规基因工程操作之用。
其中碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分 离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。只是将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ试剂和加入的比例做了修改，这种修改增加了质粒DNA在溶液中的粘度，减少了KAc的离子强度。这种方法对分子量稍大的质粒DNA更合适。
用各种不同孔径的凝胶住层析，进行分离纯化蛋白质、酶、核酸等生物样品的技术。目前也常用DNA的微量过柱以达到纯化DNA的目的。DNA的微量过柱常用Sephadex G50葡聚糖凝胶，做成约300微升凝胶的Eppendorf管小柱，对1～5微克的DNA样品离心过滤20秒钟，就能得到很高的纯化效率。这种过柱的样品可以直接进行DNA测序分析。
三、 材料
(一) 仪器
接种针 1ml移液管
1.5ml Eppendorf管 200ml吸头
冰块 牛皮纸
纱布盖 线绳
(二)器皿
微量移液器
涡流混合器
低温高速离心机
1.5mlEppendorf管
培养皿
(三)菌种
1. 大肠杆菌HB101 (pBR 322)
2. 大肠杆菌JM103 (pUCl8)
3. 大肠杆菌TGI (pBS SK + )
4. 大肠杆菌C600 pXZ6
