质粒的提取及其限制性图谱的绘制
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【原理】
1 ．质粒 DNA 的提取与鉴定原理
细菌质粒是一类闭环双链的 DNA 分子，独立于细胞染色体之外，在细胞质中 具有 自主复制能力且可稳定遗传，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具 — 载体。从大肠杆菌中提取质粒 DNA ，是一种分子生物学最基本的方法。分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等，在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。分离质粒 DNA 的方法总体包括 3 个步骤： ① 培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增； ② 收集和裂解细菌； ③ 分离和纯化质粒 DNA 。
本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。其基本原理是在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后，使 DNA （包括质粒 DNA 和基因组 DNA ）释放出来。在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液（ pH4.8 ）适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组 DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 复合物形式被高浓度盐沉淀。质粒 DNA 留在上清，进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质，乙醇沉淀质粒 DNA ，低离子强度的 TE 缓冲液溶解后，加适量 RNase A 降解残留的 RNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种： ① 共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在； ② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂； ③ 线性 DNA 。因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同，超螺旋＞线性＞开环。
2 ．质粒 DNA 限制性图谱绘制的原理
表明限制酶在 DNA 分子上的限制位点数目、限制片段大小及排列顺序的图谱称为 DNA 的限制性图谱或物理图谱。构建 DNA 限制性图谱是进行分子克隆的前提，同时分析 DNA 限制性图谱还能进行基因定位及遗传性疾病的诊断等。构建 DNA 限制性图谱的方法，大致有如下几种：双酶消化法、标记片段的部分降解法、内外混合消化法、片段杂交法、 DNA 全序列推测法。其中以双酶消化法最为常用。本实验采用双酶消化法确定 pUCm-T 质粒上 Eco R I 、 Pst I 、 Bam H I 的限制性图谱。
进行双酶消化采用的原则如下：
（ 1 ）先用限制酶单独完全降解待测定的 DNA ；
（ 2 ）再把需构建图谱的限制酶两两结合，进行完全降解。如果两个限制酶对缓冲液要求相同或相近，可以同时进行酶解；如果它们对缓冲液要求不一样，那么要求低盐缓冲液的酶先消化，然后调节盐浓度后，加入第二种酶，继续消化；如果两种酶对反应温度有不同要求，则需分别消化；
（ 3 ）把上述消化产物同时进行电泳分离，借标准 DNA 的电泳图谱，测量酶解产物的片段数目和分子量大小，要求各片段分子量之和等于或接近原有 DNA 底物的分子量，否则表明酶解不完全，难以进行图谱分析；
（ 4 ）双酶消化的片段数应是一定的。对线性 DNA ，双酶消化的片段数等于两个酶分别消化的片段数之和减 1 ；对于环状 DNA ，双酶消化的片段数为两酶单独消化片段数之和；
（ 5 ）此方法可导致 100bp ～ 200bp 的误差。
【器材】
1 ．恒温水浴箱
2 ． 10 ml 试管
3 ． 1.5 m 1 离心管
4 ．旋涡混合器
5 ．空气恒温振荡器
6 ．台式高速离心机
7 ．可调微量移液器
8 ．电泳仪、电泳槽
9 ．紫外检测仪
10 ．真空干燥器
11 ．高压蒸汽灭菌器
1 ．质粒 DNA 的提取与鉴定原理
细菌质粒是一类闭环双链的 DNA 分子，独立于细胞染色体之外，在细胞质中 具有 自主复制能力且可稳定遗传，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具 — 载体。从大肠杆菌中提取质粒 DNA ，是一种分子生物学最基本的方法。分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等，在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。分离质粒 DNA 的方法总体包括 3 个步骤： ① 培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增； ② 收集和裂解细菌； ③ 分离和纯化质粒 DNA 。
本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。其基本原理是在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后，使 DNA （包括质粒 DNA 和基因组 DNA ）释放出来。在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液（ pH4.8 ）适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组 DNA 和大分子 RNA 仍为单链，并以蛋白质 -SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 复合物形式被高浓度盐沉淀。质粒 DNA 留在上清，进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质，乙醇沉淀质粒 DNA ，低离子强度的 TE 缓冲液溶解后，加适量 RNase A 降解残留的 RNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种： ① 共价闭环 DNA ，常以超螺旋形式存在； ② 开环 DNA ，此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂； ③ 线性 DNA 。因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ，在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同，超螺旋＞线性＞开环。
2 ．质粒 DNA 限制性图谱绘制的原理
表明限制酶在 DNA 分子上的限制位点数目、限制片段大小及排列顺序的图谱称为 DNA 的限制性图谱或物理图谱。构建 DNA 限制性图谱是进行分子克隆的前提，同时分析 DNA 限制性图谱还能进行基因定位及遗传性疾病的诊断等。构建 DNA 限制性图谱的方法，大致有如下几种：双酶消化法、标记片段的部分降解法、内外混合消化法、片段杂交法、 DNA 全序列推测法。其中以双酶消化法最为常用。本实验采用双酶消化法确定 pUCm-T 质粒上 Eco R I 、 Pst I 、 Bam H I 的限制性图谱。
进行双酶消化采用的原则如下：
（ 1 ）先用限制酶单独完全降解待测定的 DNA ；
（ 2 ）再把需构建图谱的限制酶两两结合，进行完全降解。如果两个限制酶对缓冲液要求相同或相近，可以同时进行酶解；如果它们对缓冲液要求不一样，那么要求低盐缓冲液的酶先消化，然后调节盐浓度后，加入第二种酶，继续消化；如果两种酶对反应温度有不同要求，则需分别消化；
（ 3 ）把上述消化产物同时进行电泳分离，借标准 DNA 的电泳图谱，测量酶解产物的片段数目和分子量大小，要求各片段分子量之和等于或接近原有 DNA 底物的分子量，否则表明酶解不完全，难以进行图谱分析；
（ 4 ）双酶消化的片段数应是一定的。对线性 DNA ，双酶消化的片段数等于两个酶分别消化的片段数之和减 1 ；对于环状 DNA ，双酶消化的片段数为两酶单独消化片段数之和；
（ 5 ）此方法可导致 100bp ～ 200bp 的误差。
【器材】
1 ．恒温水浴箱
2 ． 10 ml 试管
3 ． 1.5 m 1 离心管
4 ．旋涡混合器
5 ．空气恒温振荡器
6 ．台式高速离心机
7 ．可调微量移液器
8 ．电泳仪、电泳槽
9 ．紫外检测仪
10 ．真空干燥器
11 ．高压蒸汽灭菌器
