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质粒的提取及其限制性图谱的绘制

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【原理】
1 .质粒 DNA 的提取与鉴定原理
细菌质粒是一类闭环双链的 DNA 分子,独立于细胞染色体之外,在细胞质中 具有 自主复制能力且可稳定遗传,大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。目前,质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具 — 载体。从大肠杆菌中提取质粒 DNA ,是一种分子生物学最基本的方法。分离制备质粒 DNA 的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等,在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。分离质粒 DNA 的方法总体包括 3 个步骤: ① 培养细菌,使质粒 DNA 大量扩增; ② 收集和裂解细菌; ③ 分离和纯化质粒 DNA 。
本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。其基本原理是在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后,使 DNA (包括质粒 DNA 和基因组 DNA )释放出来。在强碱条件下, DNA 变性成单链,当加入醋酸钾溶液( pH4.8 )适当中和 pH 时,质粒 DNA 能很好地复性,而基因组 DNA 和大分子 RNA 仍为单链,并以蛋白质 -SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 复合物形式被高浓度盐沉淀。质粒 DNA 留在上清,进一步用酚 : 氯仿 : 异戊醇抽提去除蛋白质,乙醇沉淀质粒 DNA ,低离子强度的 TE 缓冲液溶解后,加适量 RNase A 降解残留的 RNA 。
质粒 DNA 的存在形式有 3 种: ① 共价闭环 DNA ,常以超螺旋形式存在; ② 开环 DNA ,此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂; ③ 线性 DNA 。因质粒 DNA 的两条链在同一处断裂而造成。琼脂糖凝胶电泳可以鉴定质粒 DNA ,在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度不同,超螺旋>线性>开环。
2 .质粒 DNA 限制性图谱绘制的原理
表明限制酶在 DNA 分子上的限制位点数目、限制片段大小及排列顺序的图谱称为 DNA 的限制性图谱或物理图谱。构建 DNA 限制性图谱是进行分子克隆的前提,同时分析 DNA 限制性图谱还能进行基因定位及遗传性疾病的诊断等。构建 DNA 限制性图谱的方法,大致有如下几种:双酶消化法、标记片段的部分降解法、内外混合消化法、片段杂交法、 DNA 全序列推测法。其中以双酶消化法最为常用。本实验采用双酶消化法确定 pUCm-T 质粒上  Eco  R I 、  Pst  I 、  Bam  H I 的限制性图谱。
进行双酶消化采用的原则如下:
( 1 )先用限制酶单独完全降解待测定的 DNA ;
( 2 )再把需构建图谱的限制酶两两结合,进行完全降解。如果两个限制酶对缓冲液要求相同或相近,可以同时进行酶解;如果它们对缓冲液要求不一样,那么要求低盐缓冲液的酶先消化,然后调节盐浓度后,加入第二种酶,继续消化;如果两种酶对反应温度有不同要求,则需分别消化;
( 3 )把上述消化产物同时进行电泳分离,借标准 DNA 的电泳图谱,测量酶解产物的片段数目和分子量大小,要求各片段分子量之和等于或接近原有 DNA 底物的分子量,否则表明酶解不完全,难以进行图谱分析;
( 4 )双酶消化的片段数应是一定的。对线性 DNA ,双酶消化的片段数等于两个酶分别消化的片段数之和减 1 ;对于环状 DNA ,双酶消化的片段数为两酶单独消化片段数之和;
( 5 )此方法可导致 100bp ~ 200bp 的误差。
【器材】
1 .恒温水浴箱
2 . 10 ml 试管
3 . 1.5 m 1 离心管
4 .旋涡混合器
5 .空气恒温振荡器
6 .台式高速离心机
7 .可调微量移液器
8 .电泳仪、电泳槽
9 .紫外检测仪
10 .真空干燥器
11 .高压蒸汽灭菌器
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