反向高效液相层析绘制多肽图谱

胰蛋白酶切样品
尿素或盐酸胍
离心机

1. 加样前。做一次模拟加样，进行整个程序的洗脱，测 OD 初始值。记录所有实验变量：加样量、溶剂梯度、流速、吸收范围等。

2. 制备 ³²P 标记的胰蛋白酶切样品（需要几千 cpm 才能有效地检测到 ³²P 标记的多肽 )。用 0.1% TFA 悬浮样品，10000 g 离心 5 分钟使溶液澄清。如果多肽样品难以溶解，可以加入溶于 0.1% TFA 的 5 mol/L 尿素或盐酸胍。离心使溶液澄清，于加样前加 10 倍的 0.1% TFA，混合，立即加样开始层析。

3. 通过内径为 0.1 mm 的 50 cm 管将分步收集装置连到流出槽的出口，以 1 分钟为单位收集样品。

4. 通过测定 214 nm 处的光吸收监测多肽的洗脱。未标记多肽要在 214 nm 被检测到至少需要 10 pmol/L。

5. 鉴定含有 ³²P 标记的多肽的组分。