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    构建基因组区域的长距离限制性图谱

    相关实验：大范围限制性图谱：脉冲电场电泳实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    Agarose-embedded DNA 样品
    稀有的限制性内切核酸酶 10 X 缓冲液 BSA 乙酰化和去核酶处理 亚精胺盐酸 TE 缓冲液 琼脂糖 电泳缓冲液 载样液 DNA 长度标准 溴化乙锭
    100 mm petri 板 适合限制性酶切温度的水浴 脉冲电场电泳设备 脉冲发生器 带正电荷的尼龙膜

    步骤

    1. 将包埋在琼脂糖中的D N A 样品放置到一个petri板中，然后将其切成8 个大约25jnl 的 小 块 （ l m m X 4m m X 6m m )，每块含大约3^g D N A ，要小心处理样品以避免损伤 而导致条带扭曲。 2 . 将一个微量离心管置于冰上，将 以 下 的物品混合（ 总体积为 IOOfjJ , 包括琼脂糖块） ： IOjul IOX限制性内切核酸酶缓冲液； I O jlJ lmg/ml 乙酰化 BSA; 知 1 1 0 0 m m o l / L 亚精胺盐酸； 5 ( ^ 1 灭菌水。 将一个琼脂糖块放置于反应混合液中，冰 浴 5 m m 。 3. 加 15U 的稀有限制性内切核酸酶入内，混合，冰 浴 60min 以使限制酶能扩散到琼脂 糖基质中。 4 . 将 管 子 置 于 合 适 的 温 度 中 （ 表 5 . 1 . 1 或产品说明）水 浴 5 h 。对 于 5(rc的反应温度

    D N A 长度标准应散布于胶中以助于分析D N A 长度。 9. 小心地移动梳子，先将〇.5X T B E 缓冲液注满胶孔，用两个小胶铲将D N A 样品引入 到胶孔中，其中一个放置样品，用另一个打开胶孔以使样品能滑进去（ 要确保胶块 底部没有产生气泡，以免D N A 在移动过程中产生扭曲） 。 10. 将胶放到P F G E 设备中，加 入 2.5L 0.5X T B E 缓冲液，可将缓冲液预冷到10°C ， 或采用制冷装置循环缓冲液，或将电泳设备置于冰箱中。 11. 盖上胶盒的盖子（ 如 Bio-Rad系统）后就自动接通电源。对常规的分离要求和系统 而言，常采用5 V / c m 的电场强度， 90s的脉冲时间，电泳时间为48h (或参照设备 说明书） 。 12. 当分离电泳完毕，关掉电源，排掉缓冲液，将胶放置含O J y g A n l 的溴化乙锭溶液 中染色2〜24h， 染后拍照。 13. 将 用 P F G E 分离的D N A 转移的带正电荷的尼龙膜上。为了从P F G E 获得的大片段 D N A 的最佳转移，可采用酸去嘌呤的步骤，采用变性转移液和紫外线切割。 14. 将膜与用放射元素标记的探针杂交及放射自显影。使用没使用重复元件和载体序列 的 探 针 （ 或者与未标记的基因组D N A 预先退火，阻断它们的杂交)。 支持方案1 制备包埋有高分子质量的哺乳动物细胞基因组 DNA的琼脂糖块 此方案适用于大部分来源于哺乳动物细胞的活细胞，因为这些细胞能制成单细胞悬 液 ，也可用于将组织解离而得到活细胞。尽量不要使用冻存的细胞，除非没有其他的 D N A 来源，因为冻融的过程会影响样品的质量。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 1.0% (m /V ) 低熔点胶，置 于 H B S S 中 哺乳动物细胞 V H B S S , 37〇C V 细胞裂解液 V T E 缓冲液 V P M S F /T E 洗 涤缓冲液（ 新鲜配制） 50°C和 42°C水浴 阻 隔 模 子 （ 如 Bio-R a d 的阻隔模子，许 多 P F G E 系统都能提供） Beckman G P R 离 心 机 （ 带 有 GH-3. 7 的转子） 1•将装有适量的1 . 0 % 的低熔点琼脂糖胶的管子放到装有一半水的烧杯中，加热烧杯刚 好达到溶解低熔点琼脂糖胶的温度，注意要确保琼脂糖中的水不丢失，溶 卜 将其置于50°C的水中降温。 2 . 用 7 0 % 的乙醇清洗阻隔模子，组装好后，然 后 将其置于碎冰中预冷（ 也可见产品手册)。 Bio-R a d 的 阻 隔 模 子 能 形 成 容 量 为 225jlJ 的 股 孔 ，按 基 本 方 案 中 介 绍 的 方 法 切 成 l m m X 4m m X 6m m 的 胶 块 。每 一 胶 块 约 含 3j L t g D N A 。对 于 四 倍 体 或 多 倍 体 的 细 胞 ， 就 要 根 据 实 际 情 况 调 整 到 SjUg D N A ， 而 不 能 过 量 。
    3 . 室 温 150g ( B e c k m a n G H -3. 7 转子： 800r/m i n ) 离 心 8m i n 收集細胞。弃上清，用 IOml 37°C 的 H B S S 重悬细胞，混匀后制成单细胞悬液。用血细胞计数器对|田胞计数 (附录31)。 4 . 用 H B S S 重悬、离心细胞来洗涤细胞2 次。计算出使细胞浓度达到4 X IO7个/m l 的 细胞重悬体积。用比计算出的体积稍微少一点的H B S S 重悬细胞，将其小心吸人另 一个管子中，测量其实际体积。然后补加H B S S 至所计算出的体积。 5•将已融的琼脂糖从50°C 水浴移到42°C 水 浴 （ 不需严格平衡） 。将装有细胞的管子也 置 于 42°C 水 浴 ，加 人 相 词 体 积 的 42°C 的琼脂糖，混合。将细胞/琼脂糖悬液置 于 42°C 。 6 . 吸取225|u l 的细胞/琼脂糖悬液至每一个已预冷的阻隔模子中。可将模子置于冰上 5m i n 固化。用两个小铲将胶块移到装有20m l 细胞裂解液的管子中（ 足够放入I0 个 225|u l的胶块） 。将其置于50°C温 育 24h 。 7. 倾弃裂解液，再加入20m l 的新鲜的裂解液，在 50°C 再温育24h 。 8. 透析胶块2 次 ，每一次使用40m l T E 缓冲液，室温， l h 。轻柔地翻转几次管子。最 后一次是在50°C 中按同样的方法透析。 9. 用新鲜配制的P M S F /T E 洗涤液代替T E 缓冲液，然后置于50°C 中温育，重复一次。 10. 用 P M S F /T E 代替新鲜的T E 缓冲液，将胶块置于10°C 保存。 支持方案2 用啤酒酵母染色体和Y A C 制备包埋在琼脂糖块中的 高分子质量标准品 啤 酒 酵 母 （ S .ceret^ ae) 拥 有 16条长度从200〜2000k b 的染色体，这样为P F G E 提供了方便的D N A 长度标准。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 啤 酒 酵 母 （ S .cerehhae) 细胞 • VY P D 平板和培养基或A H C 平板和培养基 V 50mmol/L E D T A , pH 7. 5 7 0 % 乙醇 V S C E 缓冲液 Zymolyase 溶 液 ： 100U/ml 的 Zymolase 100T ( 干 粉 ； I C N Biomedicals) / 100mmol/L mercaptoethanol (2-M E)， 溶于 SCE 缓冲液 2-ME溶液： 70mmol/L的 2-ME，溶 于 SCE缓冲液 V 细胞裂解液 V T E 缓冲液 30°C温箱 30°C水浴摇床 250m l 离心瓶 Sorvall离心机，带 有 G S A 转 子 （ 或相当的离心机及转子） 50m l 的圆锥形离心管，带螺旋式的管盖
    树脂的阻隔模子（ Bio-Rad) 带 G S A 转子的Beckman离 心 机 （ 或相当的离心机及转子） 42°C和 50°C水浴箱 1 . 取 S.cere心 — 菌种在Y P D 平板上划线以备挑取单克隆细胞。 30°C孵 育 1〜 2d。 如 果要从携带Y A C 的酵母株中获得染色体，就用至少能筛选出一个Y A C 臂的培养基 代替酵母培养基，如 A H C 平板和培养基用于带有U R A 3 和 T R P l 的 Y A C 。 2 . 挑取一单克隆至一个装有5 m l 的液体培养基的无菌管中，在 30°C通风良好的条件下 培养过夜。 3•接种2m l过夜培养物到装在500ml灭菌瓶中的200ml培养基中，在 30°C通风良好的 条件下培养过夜。 4 . 将培养物移到2 5 0 m l的离心瓶中，室 温 5800g (相 当 于 Sorvall G S A 转 子 6000r/ m i n ) 离 心 IOmin,收集细胞。 5 . 用 15ml p H 7.5, 5 0 m m o l / L 的 E D T A 重悬细胞，然后移至一 5 0 m l 的圆锥形带螺旋 盖子 的 离 心管中，用细胞计数器计数细胞，用 5〇 m m o l / L 的 E D T A 进行稀释以调整 细胞浓度。 6. 用 7 0 % 的乙醇清洗阻隔模子，组装好后，然后将其置于碎冰中预冷。 7 . 室温离心细胞， 900g (相当于 B e c k m a n的 GH-3. 7 转 子 2000r/min) 。 用适量的zym d y a s e 溶液重悬细胞，调整其浓度为4 X 1 0 9个/ml。 & 将 1. 4 % 的低熔点琼脂糖溶化后放入50°C的水浴中冷却。 9.取 Iml的细胞重悬液（4X 109个）到一 15m l 的管中， 42°C 水浴。加人Iml的已融的 琼脂糖，混匀，继续水浴。 10. 将细胞/琼脂糖混合液加人置于冰上的阻隔模子中，放 置 5 m i n 以固化。将模子中的 胶块移到20m l 的 2- M E 溶液中， 37°C温育过夜。 一 个 225jul的 胶 块 会 形 成 一 个 l m m X 4 m m X 6 m m 的 样 品 块 ， 细 跑 浓 度 为 2 X 1 0 9 个 /ml， D N A 的 最 终 浓 度 约 为 33哗 / 4 。 1I •^倾去溶液后换成3〇 m l的细胞裂解液， 50°C温育过夜。 12. 检查白色、不透明的胶块是否变得透明了（ 如变透明就说明大部分的细胞已裂解） 。 换成新鲜的细胞裂解液，继续放置50°C中温育过夜。 13. 裂解完毕后，往管中加满T E 透析胶块，每 隔 30min至 I h 更 换 T E ，总共透析4 次 ，最后往管中加满新鲜的T E 缓冲液，连同胶块保存于10°C。 将胶块进行PF G E (见基本方案） ，电场强度： 5V /c m ，脉冲时间： 90s，电泳 36〜48h〇 支持方案3 BAC D N A 的制备、限制性消化及电泳分析 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) V 加了抗生素的L B 培 养 基 （ 抗生素浓度与培养细菌的固体培养基相同） 取大肠杆菌（ E. D H lO B 在固体培养基上划线以挑取所要的B A C 克隆/抗生 素/EPTG (25； zg/m l) /X-gaUSOpg/m l) ; 通常用于一般的B A C 载体的抗生
    素的浓度是：氣霉素12. 5jug/ml，卡那霉素25yg/ml V G T E 溶液，冰上预冷 V N a O H / S D S 溶液 V 乙 酸 钾 （potassium acetate ) 溶液 异丙醇 7 0 % 的乙醇 • 7TE 缓冲液，pH 8.0 IOU/jlJ 的 i V o d 限 制 性 内 切 核 酸 酶 和 缓 冲 液 （ N EB) 100 X B S A (NEB) V 6X 载样液 用 0. 5 % 的 T B E 配制的用于电泳的1 % 琼脂糖胶 D N A 长 度 标 准 （ 支持方案2) V 〇.5jug/m l 的溴化乙键 15ml 管 37°C的摇床温箱 带有套桶转子的离心机 37°C水浴箱或温箱 Bio-Rad C H E F 部 件 （ D R -n 、 DR-EI或 M a p p e r),配有制冷器和泵 紫外灯盒子 1 . 用一 15ml管 装 3m l的有抗生素的LB 培养基，从 DHlOB的划线平板上挑取一单克 隆至其中， 37°C摇床培养16〜18h (250r/min)。 2. I 77Og (相当于有套桶转子3OOOrAnin) 离 心 lOmin，弃去上清液，加 入 200^1在冰 上预冷的G T E 溶液，重悬细菌，然后将其移人到一微量离心管中，加 4 0 0 4 的 N a O H / S D S 溶液入内，颠倒管子进行混勻，将管子置于冰上7min。 3 . 加 300W乙酸钾溶液入内，颠倒管子进行混匀，置 于 冰 上 7min。以最高速度离心 20min。将上清液移至一新的1.5m l微量离心管中，如果还有残留的杂质，可再离心 一次以去除杂质。 4 . 加 600jul异丙醇人内，颠倒管子进行混匀，置于冰上20m in。以最 高 速 度离心25min 将 D N A 沉淀下来。移去上清液，然 后 加 入 I m l 的 7〇%乙醇，以最高速度离心 15m in，完全去除7 0 % 乙醇，将管子置于层流通风橱中风干I h 或放置试验台上风干 几小时。用 35^1 pH8. 0 的 T E 重 悬 BAC D N A 。 5. 配制消化BAC D N A 的限制性酶切反应液，如需要可增加D N A 浓度。如需要提高消 化能力，可将限制性酶的浓度提高到0.75〜lju l。 缓冲液； 0. 2yX 100X B S A ； 0. 5jla1 10U /|u.l N o t I ； 7 . 8 ^ 灭菌水； 5. 0 B A C D N A ； 总体积： 15jlJ 。
    37 C酶切5h 以上。 酶切完毕 后 加 〇.2^J 的 6X 载样液以终止消化反应，在将甘加到 C H E F 胶中以前将其保存在冰上。 6. 用 0.5%的T B E 制备一 1% 的琼脂糖胶，置于50。 〇左右冷却。当胶固化后，加 D N A 长度标准到胶中（ 支持方案2)，用融化的琼脂糖封住胶孔。 7. 加2. 5L 预 冷 （14 C ) 的 0.5X TBE到电泳槽中，将胶放入电泳槽中后，把 酶 切样品连同载样染料加入到浸没在TBE中水平摆放的胶中。电泳条件如下。切换时 间 5〜15s，采用线性扫描电压，电场强度6V/cm(200V)，电泳时间1 5 h 。 8•电泳完毕后，根据基本方案中方法用〇.5jug/m l 的溴化乙锭染胶，在紫外光的盒中检 测胶。 当观测C H E F 胶时，插入的条带会较清晰，位于载体条带的上方，载 体 pBe_ loBACll及其付生载体的大小为7. 5k b 载体的条带在所有的泳道中都应看得见。人 类的B A C 中通常有一条超过IOOkb的插入条带，因为大部分人类B A C 平均的插入 片段长度在IOOkb以上。 9 . 如何需要的话，可将股中的BAC DNA根据Southern blot的方法转移，然后与探针 杂 衮 （ 基本方案中第13和 14步)。

    来源：丁香实验

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