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核酸的提取

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核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在,核酸提取的主要步骤为:
裂解细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,如提取DNA分子时,应去除RNA,反之亦然。

沉淀核酸
纯化核酸,去除盐类,有机剂等杂质

( )DNA 提取的经典方法
DNA提取的经典方法,即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去,提取次序为酚、酚/氯仿(1:1)、氯仿,这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好,缺点是较为繁琐。
 
说明:
回收上层水相时,一定不要接触两相的界面,以免将蛋白质等物质吸入新离心管。
沉淀DNA,无水乙醇是首选的有机溶剂。另:异丙醇、醋酸钠等。

70%乙醇漂洗DNA,是为了去除残余的盐类,去除过量SDS和酚等杂物,因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态,不与DNA共沉淀,从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
TE缓冲液:10mmol/L Tris-Hcl
1mmol/L EDTA pH 8.5或 8

RNA的提取
RNA提取条件较DNA要求严格,主要是因为临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温,如煮沸也不能使之完全失活。

蛋白质变性剂可使之暂时失活,但变性剂去除后,又可恢复活性。除细胞内RNase以外,环境中灰尘、各种实验器皿和 试剂 、人体的汗液及唾液中均存在RNase,因此在提取RNA时,关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。
1.提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
塑料制品:如试管、EP管、Tip头,使用灭菌的一次性用品。

玻璃用品:如烧杯、试管和其他用品,常被RNase污染,使用前必须于180oC干燥8小时以上,或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。

DEPC是RNase的强抑制剂,作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合,使蛋白质变性。37℃浸泡2小时,然后用灭菌水漂洗数次,于100℃干烤15分钟,去除器皿上残余DEPC。

所需溶液的配制:必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学 试剂 配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,把溶液装入无RNase的玻璃器皿。
严格来说,所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上,然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟,去除残余DEPC。

2.RNA提取中RNase污染的控制
最主要的潜在污染源是操作人员的手,手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase,另外,说话带出的唾液也富含RNase,故在涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套和口罩。
实验中,如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能污染RNase,因此RNA提取实验中,应勤换手套。
 RN A提取方法

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