核酸提取 基因组DNA的提取

 

 

    DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。

    方法1，基因组总DNA的大量提取

    本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。

    一：仪器  高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪

    二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液

    三:操作 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织)
                            液氮,研碎
10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热),
                            加入等体积氯仿, 65℃放置30分钟，
间隔5－10min轻摇一次,
离心(12000-15000rpm, 15min )
                   上清液
静止下
0.6体积冷异丙醇,
0.1体积3MpH5,2乙酸钠,
                 挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥,
        2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃,10-30分复溶和除RNA
                       
等体积酚/氯仿,氯仿抽提
（轻轻混匀、冰浴沉淀5min，5000RPM离心5min，取上清）
上清液
2V无水乙醇、1/10VnaAC,
-20,2或-80℃，30min
                                 10000RPM,10min
沉 淀
70%冷乙醇洗涤
真空干燥

干粉-20℃保存，
或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存
四：鉴定
所提DNA进行Agarose胶分析（电泳过程见附），紫外观测仪观测，凝胶成像系统拍摄。
注意:
1,裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解
2，酚一定要碱平衡
      3,各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解
      4,取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.
      5,异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
      6,本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省线的特点。
      7,此方法也适合菌类基因组DNA的大量提取。