结缔组织染色法

结缔组织由细胞和大量的细胞间质构成。间质包括基质和纤维两种成分。疏松结缔组织和致密结缔组织的纤维有胶原纤维，弹力纤维和网状纤维。
光学技术切片的结缔组织染色是指胶原纤维，弹力纤维和网状纤维染色，而通常所说的结缔组织染色多指胶原纤维染色。
一、胶原纤维染色法：
胶原纤维由纤维母细胞分泌产生。纤维母细胞，纤维粗细不等直径在1－2微米之间，呈分枝状，相互交织，少量常呈明显的纤维状；成熟的和大量存在于组织时，则显均质性，具较强的的嗜酸性，在苏木素—伊红染色（简称HE染色）的切片上易于识别。但在某些情况下，它与肌纤维的鉴别是有困难的。例如纤维瘤或纤维肉瘤与平滑肌瘤或平滑肌肉瘤及横纹肌瘤及横纹肌肉瘤的鉴别。为此，适宜的采用某些特殊染色就十分必要了。如Ven Gieson氏染色法（胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色）；Masson氏三色染色法（胶原纤维呈绿色或兰色，肌纤维呈红色）。

1．Ven Gioeson氏苦味酸复红法（1889）
此法是用来区分胶原纤维和肌纤维的经典染色方法，习惯称之为V－G染色法。染液是苦味酸和酸性复红的混合液，胶原纤维被酸性复红染成淡红或红色，肌纤维被苦味酸染成黄色。
操作方法：
(1)切片脱蜡常规至水，蒸馏水洗。
(2)Weigent氏铁苏木素液染核。
(3)水洗（用自来水充分冲洗）。
(4)1％酸盐酸酒精分化
(5)流水冲洗。
(6)Ven Gieson氏苦味酸复红染色 1—5分钟。
(7)滤纸稍印干或用 95％酒精迅速脱色与脱水。
(8)无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封盖。
结果：胶原纤维红色，肌纤维黄色，核褐色。
试剂 配制：
Ven Gieson氏苦味酸复红液：
1％酸性复红 10ml
苦味酸饱和水溶液 90ml
两液混合后加适量蒸馏水稀释备用。
注意事项：
1．苦味酸复红两液应分别保存，染色前取均量（等量）混合使用。
2．酸性复红易被水洗掉，而苦味酸易被酒精洗脱，故在分色脱水时都应快速。由于V-G为较强的酸性染液，切片放置过长易褪色。

2.Masson三色染色法
Masson三色染色法是由Mallory氏苯胺蓝菊黄G发展改良而来，但对于固定液有一定的选择性，虽然任何固定液固定后的组织可进行染色，但最好是用Zenker氏固定液或Bouin氏固定液固定组织。福尔马林固定的标本切片在染色前以3%升汞作第二次固定一小时以上，则可增强着色效果。
操作方法：
(1)切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
(2)Weigent氏苏木素液染核30分钟；
(3)自来水洗；
(4)1%盐酸分化（在显微镜下控制染色，除核为黑色，片中其他均混为白色）；
(5)自来水洗；
(6)丽春红—品红溶液洗；
(7)1%醋酸水溶液洗；
(8)1%磷钼酸分化直到各种成分被染清晰（胶原纤维呈淡红色，肌纤维、纤维素呈鲜红色）；
(9)1%醋酸水溶液洗
(10)2%淡绿液染2—5分钟（或用2%苯胺蓝水溶液替代）
(11)水洗
(12)常规脱水、透明、封片。

结果：胶原纤维绿色（或蓝色），肌肉、纤维素红色，红细胞橘黄色，核蓝黑色。
试剂 配制：
1．丽春红—品红溶液
丽春红 0.7g
酸性品红 0.3—0.5g
冰醋酸 1ml
蒸馏 水 100ml
2．1%冰醋酸水溶液
冰醋酸 1ml
蒸馏 水 99ml
3．淡绿
淡绿 2.0g
冰醋酸 2ml
蒸馏水 98ml
注意事项：
1．用Weigent氏染色铁苏木素为A，B两掖等量混合液（在临用前混合）。
2．如丽春红—品红溶液及淡绿染色较深时，可加一定蒸馏水稀释染液。

二、网状纤维染色法：
网状纤维是非常细而短的纤维，大量堆集时则形成致密的网状，故有网状纤维之称。又因这种纤维只有以银盐镀染才能看见，所以又称嗜银纤维。它主要分布于肝、脾、骨髓、淋巴组织等造血器官，在病理情况下，常出现于炎症增生和肿瘤性增生组织中。
网状纤维染色，常作用于某些肿瘤的鉴别诊断，如癌与肉瘤的鉴别。还可作为恶性肿瘤的发生以及预后的观察。
网状纤维的染色方法很多，但都是嗜银浸染法，虽然各法操作步骤及染液的配制有所不同，其基本原理还是相同的。由于组织内的蛋白质与银化合物的结合，再经过还原而成为金属银，沉积于组织内及其表面，因此得以着色。
操作方法：（Gomri氏染色法）
(1)切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗。
(2)0.25％过锰酸钾5—10分钟。
(3)5％草酸漂白1－2分钟，以切片呈白色为度。
(4)流水洗，经蒸馏水洗。
(5)2％铁明矾媒染5—10分钟。
(6)蒸馏水速洗。
(7)双氨氢氧化银溶液（Gomori氨银溶液）3—5分钟。
(8)10％福尔马林还原0.5—1分钟。
(9)蒸馏水洗。
(10)以0.2%氯化金调色3-5分钟。
(11)蒸馏水洗。
(12)于5%硫代硫酸钠中固定1-2分钟。
(13)自来水洗数分钟。
(14)常规脱水，透明，封固。
结果：网状纤维黑色，胶原纤维黄色—桔黄色，细胞核呈灰黑色。
试剂配制：
双氨氢氧化银（Gomori氏氨银）溶液配制：
取10%硝酸银溶液5ml于量杯中，缓慢地逐步滴加入28%氨水，开始产生褐色沉淀，继之淀渐渐溶解，恰好溶解完为止，然后加入3%氢氧化钠5ml，再产生黑色沉淀，再滴加28%氨水，直到仅有微量沉淀为止，加蒸馏水至50ml过滤使用。此液配制后，可放入冰箱内保存1-2周，用时升至室温即可，应贮存于棕色瓶内。

三、弹力纤维染色法
弹力纤维较细，直径0.2-1微米，且坚固，弹性大，容易伸展，纤维分枝连接成网，没有原纤维，量少时不易与胶原纤维区分，量多时才可识别。HE染色与胶原纤维着色相似，若用弹力纤维染色法，则可分辨的很清楚。例如，观察血管弹力层的异常。
弹力纤维具强嗜酸性，用升汞，酒精固定染色较佳，适于福尔马林固定。
操作方法：
1. Weigert氏弹力纤维染色法：
（1）标本用Zenker氏液，酒精或10%甲醛固定均可。
（2）石蜡或冰冻切片。
（3）染色前的程序，按照常规进行。
（4） 水洗后，入Weigert氏染色液2-6小时或更长的时间，一般依染色液的新旧而定 。
（5）切片从染液中取出，直接浸入1%盐酸酒精或酒精中进行分化。
（6）如需复染细胞核，可染于明矾苏木素溶液中10分钟。
（7）冲洗后，可再以Ven Gieson氏染液作对比染色1-2分钟。
（8）95%酒精分化、脱水、透明、封固。
结果：弹力纤维呈暗蓝色，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色。
注意事项：
Weigert氏弹力纤维染色的配制已有许多改变，盐基性复红（碱性品红）可由其它盐基性染料取代，如甲紫、焦油紫（结晶紫）、维多利亚兰等。配制时如将结晶紫1克加盐基性复红1克，则弹力纤维染成兰绿色；全用甲紫或结晶紫，弹力纤维则呈暗绿色。亦有将染液以酒精加倍稀释，并相应增加盐酸量，之后延长染色时间，染色时间可达数小时甚至过夜，对纤细的弹力纤维显示更好。
试剂配制：
盐基性复红（碱性品红） 1g
间苯二酚（雷锁辛） 4-5g
蒸馏水 200ml
29%三氯化铁水溶液 25ml
95%酒精 200ml
浓盐酸 4ml
先将盐基性复红（碱性品红）溶于200ml的蒸馏水中，加入4-5g间苯二酚，加温煮沸（不停搅拌），然后加入25ml的29%三氯化铁水溶液，继续搅拌煮沸2-5分钟，冷却后过滤倾去滤液，将滤纸及沉淀物置于温箱中烘干。而后将滤纸和干燥的沉淀物一并投入 烧杯 ，加200ml95%酒精，小心隔水加热，徐徐搅拌使沉淀溶解，然后弃去 滤纸 冷却后，补足因加热蒸发的酒精。最后加入4ml的盐酸即可应用。（对苯二酚可代替间苯二酚）。
2. Verhoeff氏弹力纤维染色法：
操作方法：
（1）切片常规脱蜡。
（2）Verhoeff染液15-60分钟。
（3）以2%三氯化铁分化（镜下控制）。
（4）水洗再以95%酒精洗去碘。
（5）流水洗。
（6）以苏木素-伊红或Ven Geison氏染液复染。
（7） 脱水、透明、封固。
结果：弹力纤维蓝黑色，其它组织视复染而定。
注意事项：这种染色法染液配制简单，但对微细弹力纤维不如Weigert氏效果好。
试剂配制：
将1克苏木素加热溶于20ml的无水酒精，冷却后，加1%三氯化铁水溶液8ml搅拌；再加入 8ml的Lugoi碘液（碘1克，碘化钾2克，蒸馏水100ml）搅拌混合而成。染液仅可存放2-3周。