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应用PCR扩增T细胞受体基因重排

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1882
应用PCR扩增T细胞受体基因重排
 
【操作方法】
    (1) 引物设计:引物1~11是用于PCR的引物,其目的是扩增目的基因和分离特异性探针,分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A,产生限制性内切酶Fok1位点。
 
表 扩增TCR基因重排PCR引物
────────────────
(1)  5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’
(2)  5-’ACTCAAGCCCAGTCATGAGT-3’
(3)  5’-GCAAAGTACTTTTGTGCTCTTG-3’
(4)  5’-GGGTTCCTTTTCCAAGGATGAG-3’
(5)  5’-GAGTTACTTACTTGGTTCCAC-3’
(6)  5’-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3’
(7)  5’-TCATCCATCTCTCTCTCTTC-3’
(8)  5’-GAGTCATGTCAGCCATTGAG-3’
(9)  5’-GCACCATCAGAGAGAGATGA-3’
(10) 5’-TTGTAGCACTGTGCGTATCC-3’
(11) 5’-AGGGAAATGGCACTTTTGCC-3’
────────────────
 
     (2) 在100μl PCR反应液中含DNA 1~5μg,两条引物各30pmol,4×dNTP 200μmol/L,Tris-HCl10mmol/L(pH8.3),KCl 50mmol/L,MgCl2 3.0mmol/L,明胶0.001%;预变性92℃×12min,56℃复性2min后,加Taq DNA聚合酶3U,PCR扩增:92℃×30s,56℃×60s,72℃×90s;共35个循环。
    (3) 产生检测Vδ1-D-Jδ1重排的克隆特异性探针:①选择引物1,6对被检测的白血病细胞DNA进行PCR;②取1μl第一次扩增产物,选用引物3、4进行第二次PCR;③应用限制性内切酶FokI,切去同源的Jδ1序列;④消化后DNA标本在3%琼脂糖凝胶上分离,含有特异的(NDN)序列用DEAE膜获取并提纯;⑤纯化后的克隆特异性探针(20ng),95℃×3min后,加入200pmol/L Vδ1特异的6聚体(5’―CTCTTG―3’),32 P标记的单核苷酸。
    (4) Vδ2-Vδ3重排特异性探针:①1μg模板DNA,选用引物7、6进行PCR;②取1μl第一次PCR扩增产物,用引物9、10进行第二次PCR;③同上步骤4、5。所不同的是选用Vδ2特异性引物(5’―GT―GCCT―3’)进行克隆特异性探针的标记。
    (5) 检测白血病细胞标本:①1μgDNA,用引物1、6和引物2、5进行二次PCR(Vδ-D-Jδ1重排)或用引物7、6和引物8、11进行二次PCR(Vδ2-Dδ3重排);②二次扩增完成后,取20ng的扩增产物点在尼龙膜上,紫外线照射固定后,用特异性探针进行杂交,放射自显影后,观察结果。
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