应用PCR扩增T细胞受体基因重排

互联网2010-12-02

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应用PCR扩增T细胞受体基因重排

【操作方法】

（1）引物设计：引物1～11是用于PCR的引物,其目的是扩增目的基因和分离特异性探针,分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A,产生限制性内切酶Fok1位点。

表扩增TCR基因重排PCR引物

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(1) 5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’

(2) 5-’ACTCAAGCCCAGTCATGAGT-3’

(3) 5’-GCAAAGTACTTTTGTGCTCTTG-3’

(4) 5’-GGGTTCCTTTTCCAAGGATGAG-3’

(5) 5’-GAGTTACTTACTTGGTTCCAC-3’

(6) 5’-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3’

(7) 5’-TCATCCATCTCTCTCTCTTC-3’

(8) 5’-GAGTCATGTCAGCCATTGAG-3’

(9) 5’-GCACCATCAGAGAGAGATGA-3’

(10) 5’-TTGTAGCACTGTGCGTATCC-3’

(11) 5’-AGGGAAATGGCACTTTTGCC-3’

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（2）在100μl PCR反应液中含DNA 1～5μg，两条引物各30pmol，4×dNTP 200μmol/L，Tris-HCl10mmol/L（pH8.3），KCl 50mmol/L，MgCl₂ 3.0mmol/L，明胶0.001％；预变性92℃×12min，56℃复性2min后，加Taq DNA聚合酶3U，PCR扩增:92℃×30s,56℃×60s,72℃×90s；共35个循环。

（3）产生检测Vδ1-D-Jδ1重排的克隆特异性探针：①选择引物1,6对被检测的白血病细胞DNA进行PCR；②取1μl第一次扩增产物,选用引物3、4进行第二次PCR；③应用限制性内切酶FokI，切去同源的Jδ1序列；④消化后DNA标本在3％琼脂糖凝胶上分离，含有特异的(NDN)序列用DEAE膜获取并提纯；⑤纯化后的克隆特异性探针(20ng)，95℃×3min后，加入200pmol/L Vδ1特异的6聚体(5’―CTCTTG―3’)，³² P标记的单核苷酸。

（4） Vδ2-Vδ3重排特异性探针：①1μg模板DNA，选用引物7、6进行PCR；②取1μl第一次PCR扩增产物，用引物9、10进行第二次PCR；③同上步骤4、5。所不同的是选用Vδ2特异性引物(5’―GT―GCCT―3’)进行克隆特异性探针的标记。

（5）检测白血病细胞标本：①1μgDNA,用引物1、6和引物2、5进行二次PCR(Vδ-D-Jδ1重排)或用引物7、6和引物8、11进行二次PCR(Vδ2-Dδ3重排)；②二次扩增完成后，取20ng的扩增产物点在尼龙膜上，紫外线照射固定后，用特异性探针进行杂交，放射自显影后，观察结果。