PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因
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PCR 扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因
在B细胞发育过程中,V―D―J的重排可导致某些核苷酸的随机缺失或插入。因此,不同的B细胞克隆经PCR后产生的扩增片段长短不一。正常的多克隆淋巴细胞群的扩增片段含有不同长度的片段,电泳检查时呈现出所谓的“片状”结构,而单克隆的B淋巴细胞白血病标本经PCR扩增后,产生一明显的同一长度的扩增片段,电泳时呈现出紧密折带状结构。这就是应用PCR快速检测单克隆性的残留白血病细胞的原理。白血病细胞标本经扩增后产生110bp上下的带,而正常的多克隆细胞则呈现为片状结构。
免疫球蛋白基因的重排具有多样性,表现为PCR扩增后产物在电泳位置上的改变,同一白血病细胞克隆的扩增产物在电泳的位置上相同。因此,可以单一的应用PCR扩增,经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,溴化乙锭染色后进行观察,对残留白血病细胞克隆进行检测,也可以达到相当高的检测敏感性(1/104 ),如应用放射性同位素标记的寡核苷酸探针杂交分析,可以达到更高的敏感性。
利用引物5’末端提供的限制性内切酶位点,可以将扩增产物进行序列分析。从中选择出独特的结构,体外合成某一白血病细胞克隆所特异的寡核苷酸探针,可在个体的水平上检测残留的白血病细胞,并可进行定量分析,有助于更精确的探讨临床治疗问题。
【操作方法】
（1） 引物设计：引物1来源于FR3中的一段最保守的序列,在所有的VH家族都有同源性。该引物5’端经修饰而产生一个限制性内切酶SaLI的位点,引物序列如下:5’―CTGTCGACACGGCCGTGTATTACTG―3’，引物2的序列是与JH片段3’端相互补的反义序列,为6个JH片段中最保守的一段序列。其5’末端经点突变产生限制性内切酶Rst的酶切位点。序列如下:5’―AACTGCAGAGGAGACGGTGACC―3’寡核苷酸探针的序列为引物2的3’端上游的一段序列,因此可用于检测PCR扩增的产物,探针序列如下:5’―GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG―3’。
（2） DNA提取：参考第三节；
（3） PCR：①配制下列混合液:DNA(1μg)3μl，10×PCR缓冲液10μl，4×dNTP (2.5mol/L)8μl，引物I、2 各1 OD/100μl 2μl，DMSO 5μl，双蒸水68μl；②预变性95℃10min；③加入Taq DNA聚合酶3U(1.5U/μl)；④加入100μl矿物油后, 93℃×1min,55℃×1min,72℃×2min,共30个循环；最后一个循环72℃×10min。
（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern印迹及其结果分析。
