MHC-I单体的Mono Q柱层析

互联网2010-12-02

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MHC-I 单体的Mono Q柱层析

【试剂及材料】

1、材料

（1）快速蛋白液相色谱装置（FPLC）

（2）层析柱（Mono Q HR5/5 Column）

（3）离心过滤器（ultrafree-15，ultrafree-4）

（4）50ml 聚丙烯离心管

（5）IEC GP8R 离心机

2、试剂

（1）Buffer A ：20mM Tris(PH8.0)

（2）Buffer B ：20mM Tris(PH8.0)；500mM NaCl

（3）1 X PBS，含1μg/ml Leupeptin，1uM Pepstatin 和 2mM EDTA

【操作步骤】

（1）用离心过滤的方法更换缓冲液

A）将过S300柱后的收集的单体MHC-I样品倒入一个ultrafree-15离心过滤器，盖紧盖子。

B）将该ultrafree-15 离心过滤器放进一支50ml离心管。

C）在IEC GP8R离心机中，4℃，2000g离心，直到滤过体积达到1ml。（根据样品浓度的不同，约需要15-30分钟，依经验而定）

D）加入另外的样品，重复上述离心过滤浓缩。

E）将20mM Tris(PH8.0)缓冲液加满ultrafree-15离心滤器，颠倒混匀，再离心。目的是更换样品的缓冲液,

F）加入20mM Tris(PH8.0)至上述样品中，使其体积达到10ml。

（2）离子交换层析

A）按照操作程序，准备好HPLC层析装置，先加入buffer A 。

B）启动层析装置，待buffer A流过柱子，加入上述经过浓缩的S300组分。

C）收集含有生物素化单体HLA-1类分子的组分（S300），用ultrafree-4离心过滤器进行浓缩，方法同前。

D）用试剂（3）进行透析，平衡缓冲液

E）重复透析3次。

F）测量OD值，确定蛋白浓度，并分装为200μg/支。

G）保存样品：在液氮中速冻，然后保存于-80^o C，这种方法可以保护样品不被蛋白酶水解。