基因组结尾
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基因组结尾
鸟枪法序列数据组装成毗连序列群通常会导致超过99％的基因组被覆盖，并有很多间隙将各个毗连序列群分隔开。间隙通常来自未在基因组文库中出现的区域(如在大肠杆菌中克隆时对宿主有毒性的区域)、质量较差的序列(如来自那些因为具有二级结构而妨碍测序反应的区域)和／或复杂的重复结构。基因组结尾过程的第一步包括利用正向信息和反向信息将毗连序列群连接成大的框架。利用软件例如Bambus(Pop，Salzberg和Shumway，2002)生成的框架显示出由克隆信息连接的毗连序列群的相对顺序和方向。框架中的毗连序列群被测序间隙分隔开，这些间隙可以通过对相连的克隆插入片段进行引物步移和转座子相关测序(pGPS―1，NewEnglandsBiolabs)而轻易测序。框架彼此间的顺序未知，因为没有对应克隆模板的物理间隙(physicalgap)将之分开。在直接补齐间隙的程序启动之前，自动确认和重新测序那些只有一端成功测序的克隆通常是有益的，指向一个物理间隙以获得一对测序结果将间隙转化成序列缺失。另外，所有长度短于平均值和指向间隙的序列都用长程测序条件重新测序，以减小和补齐间隙。
为了生成物理间隙的模板，以基因组DNA为模板进行PCR，PCR产物直接测序用来填补间隙，或用转座子进行克隆和测序。因为框架的顺序未知，所以需要将每一连续区段的末端与一PCR实验中的其他连续区段末端进行对比检验。尽管这些可以通过涉及大量PCR反应的混合PCR实现，但是首选的方法是多重PCR。移液最佳多重PCR(pipette optimal multiplex PCR，POMP)是一种建立在合并(pooling)算法(Tettelin等，~999)和多重PCR基础上的方法。这种方法允许快速生成PCR产物来横跨大部分鸟枪法测序中留下的物理间隙，这可通过在间隙的两端使用设计的引物，只进行最小数量的PCR反应和移液操作来实现。当间隙两侧有重复时，引物设计为结合在毗连序列群中重复区之前，这样就生成特异的PCR产物。对于没有获得PCR产物的间隙可以使用基因组步移试剂盒(GenomeWalkerKit；ClontechLaboratories)进行延伸。这种方法利用来自接头修饰的全基因组DNA限制性酶切片段的半定向PCR，其中只有在PCR产物的一端含有基因组特异的引发位点，另一端含有一个接头特异的引物。也可以在基因组DNA上尝试对非重复区直接进行引物步查。
基因组结尾过程通常很耗时，但是测序和间隙补齐技术的改进以及许多步骤的自动化已经大大减少了完成组装微生物基因组所需要的时间和工作量。组装成为最终形式后，仍需编辑基因组序列以提高准确性和校正核酸多义性。
