蛋白质组分析中的初步分离

在分析质谱产生的二维图谱上的蛋白质斑点时，看起来似乎只有通常含量比较高的蛋白质(编码偏倚指数大于0.2)才能彻底被鉴定出来。因而，二维胶上的斑点数量不能代表可以分析的全部表达的基因的数量或种类。

Gygi等(2000)曾经计算过，在二维作图的早期阶段，如果只装入40ug酵母溶出产物，那么只有丰度超过至少51 000拷贝(每个细胞)的多肽才能被检测到。如果起始的蛋白质总量是0.5mg，那么丰度超过1000拷贝(每个细胞)的蛋白质就可以通过银染看到，但是那些每个细胞含100拷贝和10拷贝的都不能再现出来。由此作者得出结论：蛋白质表达水平的参差不齐限制了二维MS手段分析中等丰度和低丰度蛋白质的能力，因而这项技术在蛋白质组分析方面的潜力同样受到了限制。

这是一个严重的限制，因为现在丢失的蛋白质组的那部分蛋白质，从理解细胞和调控蛋白的角度来说很有可能就是最令人感兴趣的蛋白质，因为这些低丰度的多肽链通常都是调控蛋白。

突破这种僵局的一条途径是初步分离。在目前，经常介绍的有两类主要处理手段：色谱和电泳。Fountoulakis的研究组广泛地研究了第一种处理手段。在第一道工序中，Fountoulakis等人(1997)与Fountoulakis及Takacs(1998)将肝素凝胶亲和色谱作为一个初步分离步骤应用于流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白质组分的富集。然后将流感嗜血杆菌的溶出产物用基于多缓冲液交换器的聚焦层析来进行初步分离(Fontoulakis等，1998)。在另外一种工序中，Fountoulakis和Takacs(1999)利用基于TSK苯柱的疏水作用色谱法(hydrophobic interactionchromatography，HIC)来对流感嗜血杆菌的胞浆可溶蛋白进行初步分离。

在另外一个变通的处理过程中，Fountoulakis等人(1999)报道了利用羟基磷灰石色谱对万．coli的低丰度蛋白质进行了富集。所有这些不同的色谱方法都使得几百种蛋白质能够被发现和描述。这些蛋白质在原来的未分离溶出产物中是存在的，但因为浓度太低以至于检测不到。

在电泳初步分离方面，最有效的一个处理工序是基于多槽电解仪(multicompartmentelectrolyser，MCE)的设备，这种仪器是Righetti等人设计的(1990)。这个方法依赖于等电膜，并采用与IPG分离同样的固定相化学物质进行分离(Righetti，1990)。这样一个处理工序的优势很明显，有如下几点。

基于多槽电解仪的样品预分离示意

右上图显示的是一张未分离的人血清的二维图谱，相对的是三个等点聚焦分离的不同的二维图谱，样品分离是在膜中实现的，这些膜的p/值分别为：3.0～5.0、    5.0―6.0和6.0～10.5

①它提供了一种与随后的第一维分离完全兼容的方法，而且其聚焦步骤基于固定化电解质技术。

②它能在任意窄pH梯度的IPG条上收获p/值与IPG条上的pH精确匹配的蛋白质种群。

③作为②的必然结果，蛋白质发生沉淀的机会大大减少(实际上，在一个比较宽的梯度范；围内分析全细胞裂解液时，确实有较少的蛋白质沉淀的风险；相反，同样的混合物在一个窄的梯度分析时，所有非等电蛋白质的大规模沉淀可能发生，同时有很大的蛋白质共沉淀风险，除非聚焦在一个窄的pH间隔)。

④因为存在这样一个事实，即只有在同样的IPG间隔上共聚焦的蛋白质才能出现；所以可以处理更大量的样品，这样就能够检测到低丰度蛋白质。

⑤在含有蛋白质浓度极端范围的样品中(如人血清，其中一个白蛋白占据了全部组分的60％以上)，应该装配一个足够窄的等电条，以至于可以仅从混合物中除去不想要的蛋白质，这同样可以做到装载更大量的样品，而不与最大丰度的分子种类发生干扰。

⑥Herbert和Righetti(2000；Righetti，Castagna和Herbert，2001)已经将图5.5描述的设备小型化了。在这个特别案例中，一个具有5个槽的组织结构被4个膜分隔，这4个膜的p/值分别为3.0、5.0、6.0和10．5，选择这样的目的是将白蛋白这个人类血清中最丰富的蛋白质引到一个窄p/的中间槽中。这样可以浓缩其他组分，以检测到更多的、在pH的其他区域稀释的成分。由于正确地利用了这种初步分离的设备，可以捕获和检测到更多的、“看不见的”酵母膜蛋白组(Pedersen等，2003)。

这些发现的重要性是很明确的：内在膜蛋白在二维图谱上很少看到；编码偏倚指数(codonbias index，CBl)小于0．2代表的是低丰度蛋白，它们在二维图谱上也几乎检测不到，除非采用某些初步分离方案先进行富集。编者的方法不仅依赖于初步分离步骤，而且还解决了完整蛋白质的分析问题，又不止于分析蛋白酶解产物。按照惯例，大多数处理方案需偶联色谱处理过程，但编者的方法其效果从图5．6就可以看出来。在酵母中，还原型辅酶I―细胞色素b5还原酶有两种形式，一种称为p34(pi8.7，分子质量34kDa)，另外一种是p32(pJ7.8，分子质量30kDa)。第一个组分是一个完整外膜蛋白，它介导细胞色素b5的还原反应；第二个组分是第一个组分经过体内的蛋白酶裂解得到的，是可溶的，并居于内膜空间。编者的富集方案结合了对所有完整多肽链的二维分析，完全可以检测到这两个组分。另外，编者可以很容易地观察到p34链的两个异构体，其中一个的p／值是8.，另外一个更碱性，pJ值是9.1。色谱技术如果只依赖于全细胞消化产物中的一个(或少数几个)多肽的出现，将不能检测这些多肽的其他生物相关的形态。

酵母膜蛋白的初步分离和富集以及p34还原型辅酶I―细胞色素b5还原酶的截断体和异型体的检测。